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¿Cuál es el ARNr 16S de referencia?

¿Cuál es el ARNr 16S de referencia?


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Recientemente, me encontré con un hecho que no me ha molestado durante muchos años. El hecho es que todos los cebadores 16S universales se escriben como "[FR] [0-9] +" (en notación regex), es decir, tienen una posición con respecto a una referencia. He leído muchos artículos en los que se introdujeron estos primers, y la mayoría de las veces los autores no dicen nada más que "E. coli 16S". De todos modos, en un caso he descubierto que de hecho es la referencia K12 E. coli. Pero el problema es que tiene 7 operones de ARNr distintos: rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG. ¿Tiene una referencia que muestre un operón particular utilizado para la notación de posición 16S?

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Figura 2. Regiones hipervariables dentro del gen rRNA 16S en Pseudomonas. La línea trazada refleja las fluctuaciones en la variabilidad entre las secuencias de genes de ARNr 16S alineadas de 79 cepas de tipo Pseudomonas ... (Bodilis et al., 2012)


Como señala correctamente, diseñar un par de cebadores óptimo para la secuenciación del ARNr 16S es un asunto complicado porque incluso las regiones menos variables no son las mismas entre diferentes cepas y especies. Sambo et al (2018) incluso han desarrollado un software de bioinformática para el diseño óptimo de cebadores para la secuenciación de ARNr 16S para múltiples bacterias.

Proponemos aquí un método computacional para optimizar la elección de conjuntos de cebadores, basado en la optimización multiobjetivo, que simultáneamente: 1) maximiza la eficiencia y especificidad de la amplificación de la diana; 2) maximiza el número de diferentes secuencias bacterianas 16S emparejadas por al menos un cebador; 3) minimiza las diferencias en el número de cebadores que coinciden con cada secuencia bacteriana 16S. Nuestro algoritmo se puede aplicar a cualquier longitud de amplicón deseada sin afectar el rendimiento computacional.

Existe diversidad en los genes de ARNr 16S dentro de la misma especie, es decir, las diferentes copias no son duplicados exactos (Větrovský & Baldrian, 2013).

Větrovský y Baldrian (2013)

Curiosamente, los diferentes operones de ARNr en E. coli tienen diferentes promotores e incluso se expresan diferencialmente durante condiciones de estrés (Kurylo et al., 2018).

Sin embargo, Kitahara et al. (2012) encontraron que los genes 16S-rRNA aislados de muestras de suelo, en lugar del original E. coli gen, podría apoyar su crecimiento. En otras palabras E. coli es muy resistente a mutaciones en su ARNr 16S.

Después de la contra-selección, se obtuvieron 200 clones de derivados de KT103 (portadores de pRB103 cuyo gen de ARNr 16S se sustituyó con genes extraños), de los cuales se identificaron 33 genes de ARNr 16S no redundantes (A01-H03). A través de la alineación múltiple de ARNr 16S de E. coli y nuestras secuencias de ARNr 16S recuperadas metagenómicamente, se encontró que al menos 628 (40,7%) de los 1542 nucleótidos eran variables, lo que indica una marcada robustez mutacional del ARNr 16S. Sorprendentemente, las secuencias funcionales de ARNr 16S (excepto A10 y F02, que eran 99.0% idénticas al ARNr 16S de E. coli) obtenidas en este estudio mostraron solo 80.9-89.3% de identidad con ARNr 16S de E. coli, que estaba muy por debajo del valor informado. hasta ahora (ARNr 16S de Proteus vulgaris, 94% de identidad con ARNr 16S de E. coli)


Para tu pregunta

Pero el problema es que tiene 7 operones de ARNr distintos: rrnA, rrnB, rrnC, rrnD, rrnE, rrnF, rrnG. ¿Tiene una referencia que muestre un operón particular utilizado para la notación de posición 16S?

No creo que ninguno de ellos se considere la referencia. El completo E. coli La secuencia de 16S-rRNA informada en NCBI parece considerar un "consenso" de diferentes secuencias informadas:

[5], [7] contienen datos de secuencia actualizados para el trabajo original del mismo laboratorio [4]. Había demasiadas discrepancias entre [4] y [5], [7] para enumerar cada revisión en nuestra tabla de sitios. La secuencia que se muestra es de [7]. [4], [5], [7] apuntan a una serie de heterogeneidades de cistrones. Sin embargo, existe incertidumbre con respecto a la asignación de estas diversas heterogeneidades a cistrones específicos. El método de ARN utilizado por [4], [5], [7] da el promedio de todos los cistrones presentes en la célula [7]. Las heterogeneidades se clasifican por sus proporciones relativas en especies mayores, menores e indeterminadas. La secuencia que se muestra corresponde a las especies principales. Las heterogeneidades se anotaron como variaciones en la tabla de sitios. No se sabe cuál de los residuos 'c' (base 633) o 'a' (base 641) sufre una deleción, dando lugar al componente menor 'atctg'. [7] sugiere la existencia de uno o dos cistrones mutados entre los siete cistrones conocidos del ARN ribosómico. Con la excepción de una deleción de una sola base, esta secuencia es idéntica a la secuencia actual del rDNA 16S para el gen rRNB de E. coli.

La página del NCBI también enumera diferentes polimorfismos y modificaciones de bases en el ARNr 16S dentro y entre diferentes cepas / "especies".

NCBI también tiene varias secuencias parciales. Cuando busqué P. aeruginosa y B. subtilis, Pude encontrar solo una o dos secuencias completas (el resto fueron parciales). Además, cada entrada indica la cepa de la que se obtuvo. Por lo tanto, asumo que no existe una secuencia de referencia única.

Supongo que la gente considera las diferentes variantes al hacer un análisis filogenético (o simplemente busca secuencias de "firma" conservadas para una especie determinada). Estoy seguro de que existen algoritmos computacionales para hacer la clasificación de manera óptima (ver Chatellier et al., 2014). Dado que no tengo experiencia en esta área, no puedo decir nada concluyente sobre la práctica de rutina. De hecho, todavía hay investigaciones en curso para mejorar el análisis (por ejemplo, Yang et al., 2016 y Sambo et al., 2018).


  • Este método es eficaz para identificar diferencias generales de grupos de patógenos.
  • Las secuencias del gen de ARNr 16S contienen regiones hipervariables que pueden proporcionar secuencias de firma específicas de especie útiles para la identificación bacteriana.
  • Este método también se puede ajustar para identificar patógenos a nivel de especie.
  • ribosomas: Máquina molecular grande y compleja, que se encuentra dentro de todas las células vivas, que sirve como sitio principal de síntesis de proteínas biológicas.

El ARN ribosómico 16S (o ARNr 16S) es un componente de la subunidad pequeña 30S de los ribosomas procarióticos. Tiene aproximadamente 1,5 kb (o 1500 nucleótidos) de longitud. Los genes que lo codifican se denominan ADNr 16S y se utilizan en la reconstrucción de filogenias. Pueden existir múltiples secuencias de ARNr 16S dentro de una sola bacteria.

Figura: ARN ribosómico: Estructura y forma del ribosoma de E. coli 70S. La subunidad ribosómica grande 50S (rojo) y la subunidad ribosómica pequeña 30S (azul) se muestran con una barra de escala de 200 & Aringngstrom (20 nm). Para la subunidad 50S, se muestran los ARNr 23S (rojo oscuro) y 5S (rojo anaranjado) y las proteínas ribosomales (rosa). Para la subunidad 30S, se muestran el ARNr 16S (azul oscuro) y las proteínas ribosómicas (azul claro).

El gen 16SrRNA se utiliza para estudios filogenéticos, ya que está altamente conservado entre diferentes especies de bacterias y arqueas. Carl Woese fue pionero en este uso de ARNr 16S. Además, también se amplifica el ARNr mitocondrial y cloroplástico. Desafortunadamente, aunque se pueden definir cebadores para amplificar este gen a partir de genomas individuales, este método no es lo suficientemente preciso para estimar la diversidad de comunidades microbianas de sus entornos. Los límites principales son la falta de cebadores universales reales, los sesgos de amplificación del ADN y la selección de la base de datos de referencia afectan la anotación de las lecturas.

Paradójicamente, la negación metodológica es ahora una regla en los artículos publicados que utilizan encuestas de amplicones de genes de ARNr 16S para estudiar comunidades microbianas desconocidas. En estos artículos, se utiliza un par de cebadores (aunque muchos de ellos están diseñados y proporcionan resultados diferentes) para amplificar una región del gen de ARNr 16S. Además de los sitios de unión de cebadores altamente conservados, las secuencias del gen de ARNr 16S contienen regiones hipervariables que pueden proporcionar secuencias de firma específicas de especie útiles para la identificación bacteriana. Como resultado, la secuenciación del gen 16S rRNA se ha vuelto frecuente en microbiología médica como una alternativa rápida y barata (aunque inexacta) a los métodos fenotípicos de identificación bacteriana. Aunque originalmente se usó para identificar bacterias, posteriormente se descubrió que la secuenciación 16S era capaz de reclasificar las bacterias en especies o incluso géneros completamente nuevos. También se ha utilizado para describir nuevas especies que nunca se han cultivado con éxito.


¿Qué es el ARNr 16S?

El ARNr 16S es un tipo de ARNr responsable de formar la subunidad pequeña del ribosoma procariota. Significativamente, el tamaño del ARNr 16S es 1542 nt. Generalmente, tiene un papel estructural similar al del ARNr en la subunidad grande para anclar las proteínas ribosomales en posiciones definidas. Además, facilita la unión de la subunidad pequeña a la subunidad grande al interactuar con el rRNA 23S en la subunidad grande.

Figura 1: Estructura de ARNr 16S

Además, la estructura tridimensional del ARNr 16S consta de cuatro dominios. Además, el extremo 3 & # 8242 del ARNr 16S contiene una secuencia ti-Shine-Dalgarno, que puede unirse a la secuencia Shine-Dalgarno del ARNm que será traducido por el ribosoma. Generalmente, en el ARNm, esta secuencia ocurre alrededor de las ocho bases cadena arriba del codón de inicio, AUG. Por otro lado, el ARNr 16S es responsable de estabilizar el emparejamiento del codón y el anticodón en el sitio A del ribosoma.


Nuevas bases de datos de RNA BLAST ribosomal disponibles en el servicio BLAST web y para descargar

Tenemos un conjunto curado de secuencias de referencia de ARN ribosómico (ARNr) (Loci dirigido) con fuentes de organismos verificables y nombres actuales. Este conjunto es fundamental para identificar y clasificar correctamente las muestras de procariotas (bacterias y arqueas) y hongos (Tabla 1). Para proporcionar un fácil acceso a estas secuencias, recientemente agregamos un Bases de datos de ARNr / ITS sección en la página BLAST de nucleótidos para estas secuencias dirigidas que hace que sea conveniente identificar rápidamente los organismos fuente (Figura 1)

Tabla 1. Secuencias de ARNr dirigido seleccionadas por NCBI ahora disponibles como bases de datos BLAST.

Figura 1. El menú de selección de la base de datos en la página BLAST de nucleótido-nucleótido con el botón de radio de la base de datos rRNA / ITS seleccionado.

El uso de estas bases de datos para la identificación acelerará sus búsquedas y le proporcionará los resultados más informativos. Si desea ampliar su búsqueda para incluir secuencias de ARNr 16S no curadas, cambie a la Recolección de nucleótidos (nr / nt) base de datos. Es posible que también desee configurar el Organismo filtrar a su grupo taxonómico de interés.

También puede descargar estas nuevas bases de datos desde el directorio FTP de BLAST db para usarlas en búsquedas BLAST locales.


Secuenciación de ARNr 16S de próxima generación

Muchos sitios del cuerpo humano están colonizados por comunidades complejas de microbios (el "microbioma humano") tanto en la salud como en varios estados de enfermedad. Las muestras polimicrobianas muy diversas a menudo son difíciles, o incluso imposibles, de caracterizar completamente mediante técnicas de uso clínico común:


Figura 1. Ejemplos de resultados de secuenciación del gen ARNr 16S convencional a partir de un aislado bacteriano y una muestra polimicrobiana. Para el aislado bacteriano (arriba), los datos de la secuencia de Sanger producen un electroferograma limpio que puede usarse para proporcionar una clasificación taxonómica a nivel de especie. Para la muestra polimicrobiana (abajo), la secuenciación de Sanger genera un electroferograma diferente para cada especie presente, lo que da como resultado una señal mixta que no se puede interpretar.
  • La identificación basada en cultivos se basa en la capacidad de los organismos para crecer y replicarse in vitro. Por lo tanto, la detección de organismos exigentes o de crecimiento lento, o aquellos que se vuelven inviables debido al procesamiento (como en muestras de tejido embebidas en parafina fijadas con formalina) o durante el almacenamiento (como anaerobios que han estado expuestos al oxígeno) es limitada. Además, solo un número limitado de especies puede clasificarse prácticamente con este enfoque.

Figura 2. Ampliación de alta potencia de un experimento de secuenciación de próxima generación. Cada mancha fluorescente representa una molécula de ADN individual en secuenciación. El color de la mancha indica la identidad del nucleótido que se interroga durante el ciclo de secuenciación actual. Imagen de Shendure, Porreca et al. Ciencia (2005).

A diferencia de los enfoques convencionales, la secuenciación de ADN de próxima generación (denominada alternativamente "NGS", "secuenciación de alto rendimiento", "secuenciación masivamente paralela" o "secuenciación profunda") proporciona datos de secuencia independientes de millones de moléculas de ADN individuales (Figura 2), lo que permite clasificar cada fragmento de forma independiente.

Esta capacidad única se extiende a las ventajas de los métodos moleculares actuales al permitirnos catalogar los organismos presentes incluso en comunidades bacterianas polimicrobianas muy complejas, directamente a partir de muestras de pacientes.

Información sobre ensayos disponibles

Nuestro laboratorio ofrece actualmente secuenciación de ADN de próxima generación de Illumina de alta fidelidad de muestras clínicas que contienen múltiples plantillas de ADN bacteriano. Los métodos se validan con fines de diagnóstico clínico molecular y atención al paciente. Los servicios de investigación también están disponibles; comuníquese con nosotros para obtener información adicional.

Esta prueba está disponible como prueba de reflejo para muestras que se espera que sean polimicrobianas basadas en PCR bacteriana de amplio rango.

Comuníquese con [email protected] para obtener detalles o preguntas.


Informes clínicos

Una vez finalizadas las pruebas, se emite un informe que describe los resultados de la secuenciación de próxima generación 16S. Para ver un informe de muestra, haga clic aquí o en la miniatura de la izquierda.

Para obtener información adicional sobre cómo enviar una solicitud y recibir un informe, comuníquese con nosotros.


¿Cuál es el ARNr 16S de referencia? - biología

Esta capacitación comenzará con la presentación de una tubería 16S (http://lotus2.earlham.ac.uk/) en un entorno Galaxy.

Esto permitirá el preprocesamiento de los datos que van desde lecturas sin procesar hasta tablas taxonómicas y árboles filogenéticos.

La segunda parte de la formación ofrecerá una visión general de la ecología numérica y participa íntegramente en R.

Procesamiento y análisis estadístico de experimentos metagenómicos de ARNr 16S utilizando el pipeline R & amp Lotus.
Los siguientes pasos analíticos, desde los datos brutos hasta los resultados comunicables, estarán en el programa:

  • Planificación, ejecución y análisis de experimentos metagenómicos
  • Analizar datos de secuenciación de amplicones con herramientas actualizadas y cómo aumentar la calidad de ASV y OTU, cuándo usar qué técnica
  • Posagrupación de ASV para evitar falsos positivos intragenómicos de ASV
  • Trabajando con experimentos de baja biomasa, eliminando la contaminación exógena en varios escenarios
  • Flujo de trabajo de análisis centrado en la ecología numérica para estudios basados ​​en secuenciación de amplicones y metagenómicos
  • Análisis de la diversidad alfa / beta
  • Estadísticas univariadas para identificar especies enriquecidas en grupos de muestra
  • Visualización y estadísticas multivariadas para identificar grupos de muestras
  • Evaluación de comunidades microbianas sobre la base de principios ecológicos y distribución de especies.

La capacitación está destinada a personas que tienen alguna experiencia con R. Si no tiene experiencia con R, puede seguir primero nuestra capacitación de introducción a R.

Entrenadores

Falk Hildebrand

Falk Hildebrand es un bioinformático apasionado por los ecosistemas microbianos, la evolución bacteriana y el desarrollo de sistemas computacionales para abordar estos temas en una perspectiva combinada. Falk se unió al Earlham Institute a principios de 2019, donde su nuevo Hildebrand Group (también en Quadram Institute) desarrollará herramientas metagenómicas para rastrear cepas bacterianas a altas resoluciones, para predecir sus capacidades genómicas y explorar sus asociaciones con enfermedades.

Durante su carrera inicial, Falk trabajó en la Universidad de Constanza (Alemania) y la Universidad de Sussex (Reino Unido) en la evolución bacteriana y el seguimiento de brotes de patógenos mediante el seguimiento de cambios en sus genomas. Pasando de una visión centrada en el genoma a una visión metagenómica de ecosistemas microbianos completos, trabajó durante su doctorado en la Universidad de Bruselas (Bélgica) sobre asociaciones bacterianas con enfermedades complejas como la EII, la obesidad y la diabetes. Para ello, Falk desarrolló pipelines bioinformáticos para procesar datos 16S (LotuS) así como las herramientas estadísticas.

Durante su posdoctorado en EMBL Heidelberg (Alemania), Falk continuó su investigación sobre la asociación al microbioma humano de enfermedades complejas como la diabetes y la enfermedad de Parkinson, entre otras. Sus intereses pronto se desarrollaron para rastrear cepas en los conjuntos de datos metagenómicos, así como para ensamblar genomas de novo a partir de metagenomas. Estas técnicas se aplican principalmente al microbioma intestinal de los mamíferos. Otro de sus intereses es la metagenómica ambiental. Por ejemplo, en 2018 demostró que en los suelos más hongos suelen estar conectados a una mayor resistencia a los antibióticos en las bacterias, y esto es cierto a escala local pero también global.

Ezgi Özkurt

Ezgi nació en Estambul, Turquía. Estudió Biología Molecular y Genética en la Universidad Técnica de Oriente Medio, Ankara y recibió su B.Sc. en 2014. Continuó su formación en la facultad de Biología de la misma universidad donde obtuvo su M.Sc. diploma en 2015.

Ezgi siguió su interés por la biología evolutiva y continuó sus estudios en el Instituto Max Planck de Biología Evolutiva en Alemania, trabajando dentro del grupo de Genómica Ambiental como estudiante de doctorado. Obtuvo su doctorado en 2020.

Ezgi trabaja actualmente como Postdoctorado en el grupo Hildebrand. Sus principales intereses son el análisis de datos metagenómicos y la transmisión vertical de comunidades microbianas.

Joachim Fritscher

Joachim Fritscher estudió Bioinformática en su BSc y MSc. Se metió en metagenómica al final de su maestría y escribió su tesis sobre un clasificador taxonómico basado en k-mer para lecturas metagenómicas utilizando una referencia de proteína.

Ahora Joachim está tratando de utilizar el enfoque basado en k-mer, así como otros métodos para mejorar la resolución de la clasificación taxonómica y las llamadas SNP al nivel de cepa. También se esfuerza por aprender y aplicar nuevos métodos sobre datos biológicos y hacerlos eficaces con C ++.

Stefano Romano

Stefano Romano estudió en la Universidad “Sapienza” de Roma y completó su doctorado en el Instituto Max Planck de Microbiología Marina en Bremen, Alemania. Antes de trasladarse al Quadram Institute Bioscience, trabajó en el University College Cork en Irlanda y en la Universidad de Viena, Austria.

La trayectoria profesional de Stefano sigue la visión del filósofo chino Lao Tzu, quien dijo que “la vida es una serie de cambios naturales y espontáneos”. Ha participado en varios proyectos de investigación de microorganismos marinos y de agua dulce, bacterias simbióticas y de vida libre, aspectos microbiológicos básicos y aplicaciones biotecnológicas. Todos estos temas cayeron bajo su principal interés de comprender los mecanismos que utilizan las bacterias para interactuar con su huésped y su microbiota en un entorno cambiante.

En el Instituto Quadram, Stefano Romano estudia el papel de la microbiota humana en el envejecimiento, centrándose particularmente en el eje microbiota-cerebro-intestino para comprender los mecanismos de interacción que sustentan la interacción huésped-microbiota y traducir estos hallazgos en intervenciones terapéuticas mejoradas. También es gerente de la instalación de trasplante de microbiota fecal en colaboración entre el Quadram Institute Bioscience y Norfolk and Norwich University Hospital.

Ángela Del Castillo Izquierdo

Ángela Del Castillo Izquierdo es una estudiante de postgrado de Maestría en Investigación dentro del grupo Hildebrand como parte del ISP de Microbios Intestinosos y Salud. Ella está investigando la composición microbiana desde una perspectiva de múltiples reinos a través de diferentes enfermedades. Sus intereses de investigación incluyen ecología y evolución microbiana, genética de poblaciones y patogénesis bacteriana.

Antes de unirse a QIB, recibió mi BSc (Hons) Biology de la Universidad de York en 2019, donde emprendió un proyecto que investigaba los factores de segregación del ADN involucrados en la segregación de plásmidos y llevó a cabo una disertación estudiando el mecanismo responsable de la segregación de una copia baja. número de plásmido en Sulfolobus solfataricus archaeon en el grupo Barillà

Rebecca Ansorge

Rebecca Ansorge estudió en la Universidad de Bremen, Alemania, donde obtuvo una licenciatura en biología y una maestría en microbiología en la Escuela Internacional de Investigación Max Planck de Microbiología Marina. Obtuvo su doctorado en el Instituto Max Planck de Microbiología Marina en 2019, estudiando simbiosis animal-microbio principalmente utilizando metagenómica. Está fascinada por la diversidad de cepas y sus implicaciones en los sistemas e interacciones huésped-microbio.

Rebecca es actualmente postdoctoral en el grupo Hildebrand en Quadram Institute Bioscience, profundizando su investigación sobre la variación del nivel de cepa microbiana y la diversidad del pangenoma microbiano en el microbioma intestinal humano. Está particularmente interesada en iluminar la relevancia de esta diversidad a gran escala en la salud y la enfermedad.

Nicola Soranzo

Nicola Soranzo trabaja en el Earlham Institute (EI) desde 2014 como parte del grupo Data Infrastructure and Algorithms. Gestiona un servidor web Galaxy que se utiliza para ejecutar análisis bioinformáticos a gran escala de forma accesible, reproducible y transparente. Nicola ha estado colaborando durante muchos años en el desarrollo de código abierto de la plataforma Galaxy y de las herramientas y flujos de trabajo de Galaxy.
Es coautor de más de 25 artículos de revistas revisados ​​por pares y ofrece capacitación regular para Carpentries y Galaxy Training Network.
Desde 2018, Nicola también es Coordinadora Técnica de ELIXIR-UK, el Nodo de ELIXIR en el Reino Unido (una organización paneuropea que coordina los recursos de las ciencias de la vida en una única infraestructura de investigación). Además, Nicola es uno de los líderes de la Comunidad Galaxy en ELIXIR.
Antes de unirse a EI, Nicola completó una maestría en Ciencias de la Computación en la Universidad de Udine y un doctorado en Genómica Funcional y Estructural en SISSA, Trieste, luego trabajó durante 5 años en Biología de Sistemas y Galaxy en CRS4, Italia.


Pato, M. L. y Meyenburg, K. V., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 35, 497 (1970).

Rose, T. K., Mosteller, R. D. y Yanofsky, C., J. Moi. Biol., 51, 541 (1970).

Colli, W., Smith, I. y Oishi, M., J. Mol. Biol., 56, 117 (1971).

Rosset, R., Monier, R. y Julien, J., Toro. Soc. Chim. Biol., 46, 87 (1964).

Zimmerman, R. A. y Levinthal, L., J. Mol. Biol., 30, 349 (1967).

Bremer, H. y Yuan, D., J. Mol. Biol., 38, 163 (1968).

Mueller, K. y Bremer, H., J. Mol. Biol., 38, 329 (1968).

Anderson, Z. H., Proc. US Nat. Acad. Sci., 32, 120 (1946).

Bremer, H. y Yuan, D., Biochim. Biophys. Acta, 169, 21 (1968).


Información del autor

Afiliaciones

Instituto Carl R. Woese de Biología Genómica, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Champaign, IL, EE. UU.

Nam-Phuong Nguyen, Tandy Warnow y Bryan White

Departamento de Bioingeniería, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Champaign, IL, EE. UU.

Departamento de Ciencias de la Computación, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Champaign, IL, EE. UU.

Centro de Bioinformática y Biología Computacional, Universidad de Maryland, College Park, College Park, MD, EE. UU.


Gran parte de la taxonomía microbiana y los análisis metagenómicos actuales se basan en estudios del gen bacteriano del ARN ribosómico 16S (16S). El ARNr 16S es un componente de la subunidad pequeña 30S del ribosoma procariota, que es un gen esencial en todas las bacterias y arqueas. Su gen correspondiente tiene una longitud aproximada de 1500 bases, y tiene regiones variables y altamente conservadas, lo que lo convierte en un marcador taxonómico ideal. Por lo general, los cebadores que están diseñados para coincidir con regiones conservadas en el gen 16S se utilizan para determinar la secuencia de ADN completa mediante amplificación por PCR. La secuencia de regiones variables entre los cebadores proporciona suficiente información taxonómica para hacer coincidir cada fragmento de ADN amplificado con una base de datos de secuencias 16S conocidas y proporciona una identificación putativa del organismo que contenía ese fragmento de ADN en su genoma. La mayoría, si no todas, las bacterias se pueden diferenciar secuenciando amplicones derivados de una de las siguientes regiones variables: V1-V3, V3-V4 o V3-V5.

Para el estudio de la metagenómica, la secuenciación 16S tiene una gran fuerza, ya que este método selecciona automáticamente solo ADN bacteriano para la amplificación y secuenciación y proporciona una secuencia de pequeños marcadores taxonómicamente informativos extremadamente eficiente para medir la abundancia de cada taxón. Se han desarrollado varias herramientas para determinar la clasificación de secuencias del metagenoma 16S, como SINA integrado en SILVA, Clasificador en RDP y QIIME. El último QIIME envuelve muchos paquetes que pueden usarse para manejar múltiples procesos y, por lo tanto, se ha convertido en la herramienta dominante.

Servicios de secuenciación de ARNr 16S en Creative Biogene

Creative Biogene ofrece un servicio de secuenciación para el gen ARNr 16S de sus colonias bacterianas o fúngicas de forma rápida y eficaz. Para identificar la comunidad microbiana en su muestra, proporcionamos un servicio integral que realiza extracción de ADN, PCR, secuenciación y ensamblaje para ahorrarle tiempo en el banco.

Creative Biogene también proporciona servicios de análisis bioinformático avanzado, que incluyen i) análisis de metagenoma de ARNr 16S ii) Asignación taxonómica y estimación de abundancia de lectura para todas las OTU hasta el nivel de especie iii) Estimación de abundancia de OTU bacterianas y arqueales considerando el número de copias de genes marcadores específicos del linaje . Como servicio adicional, Creative Biogene también aislará y purificará el ADN de alto peso molecular de diversos materiales de partida.

Aplicaciones:
• Secuenciación del gen de ARNr 16S
• Análisis del metagenoma del ARNr 16S
• Aislamiento y purificación de ADN
• Identificación de especies bacterianas

Ventajas:
• Alta calidad
• Entrega rápida y confiable
• Servicio de atención al cliente dedicado y de fácil acceso

Referencia
1. Hao, Y., Pei, Z., Brown, S.M. (2017) Bioinformática en el análisis de microbiomas. Métodos en microbiología. 44: 1-18.

Figura 1 Representación esquemática del ARNr 16S de Escherichia coli.
(Métodos en Microbiología 2017)


Principios y flujo de trabajo de la secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS

Este artículo muestra qué es la secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS y cómo funciona. Preparémonos para aprender.

La secuenciación de amplificación 16S / 18S / ITS utiliza la plataforma de secuenciación de próxima / tercera generación y realiza una secuenciación de alto rendimiento de productos de PCR de regiones específicas como 16S rDNA / 18S rDNA / ITS / genes funcionales. Supera la desventaja de algunos microorganismos de difícil o imposible cultivo, y obtiene la información de la estructura de la comunidad microbiana, las relaciones evolutivas y la correlación microbiana con el medio ambiente en muestras ambientales.

¿Qué es rDNA 16S / rDNA 18S / ITS?

  • ADNr 16s: El ADNr 16S es una secuencia de ADN que codifica el ARNr de subunidades pequeñas de procariotas con una longitud de aproximadamente 1542 pb. Con un tamaño molecular moderado y una tasa de mutación baja, el rDNA 16S es el marcador más utilizado en el estudio de la sistemática bacteriana. La secuencia de rDNA 16S consta de 9 regiones variables y 10 regiones conservadoras, las secuencias de la región conservadas reflejan las relaciones genéticas entre especies, mientras que las secuencias de la región variable reflejan la diferencia entre especies. La secuenciación del rDNA 16S se utiliza principalmente para analizar la diversidad de bacterias o arqueas.


Figura 1 cebadores de amplificación y rDNA 16S

  • ADNr 18S: El ADNr 18S es una secuencia de ADN que codifica el ARNr de subunidades pequeñas de los ribosomas eucariotas. Al igual que el rDNA 16S, la secuencia del rDNA 18S también consta de regiones conservadoras y regiones variables (V1-V9, ausencia de V6). Entre las regiones variables, V4 tiene la información de base de datos más completa y el mejor efecto de clasificación, es la más utilizada y la mejor opción para las notas de análisis del gen 18S rRNA. La secuenciación del ADNr 18S refleja las diferencias de especies entre organismos eucariotas en muestras dadas.


Figura 2 cebadores de amplificación y rDNA 18S

  • SU: ITS (Espaciador transcrito interno) es parte de la región no transcripcional del gen del ARNr fúngico. Las secuencias ITS utilizadas para la identificación de hongos generalmente incluyen ITS1 e ITS2. Porque en los hongos, los genes de ARNr 5.8S, 18S y 28S están altamente conservados, mientras que ITS puede tolerar más mutaciones en el proceso evolutivo debido a una menor presión de selección natural y exhibe un polimorfismo de secuencia extremadamente amplio en la mayoría de los eucariotas. Al mismo tiempo, el tipo conservador de ITS es relativamente consistente dentro de las especies, y las diferencias entre especies (o alguna vez manchas) son obvias. Los fragmentos de secuencia de ITS son pequeños (350 pb y 400 pb de longitud, respectivamente) y fáciles de analizar. Se han utilizado ampliamente en el análisis filogenético de diferentes hongos.


Fig.3 ITS y cebadores de amplificación

¿Qué es la secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS?

La secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS utiliza la secuenciación de Illumina o PacBio para leer los productos de PCR que se amplifican con cebadores universales adecuados de una o varias regiones de 16S / 18S / ITS. Al detectar la variación de la secuencia y la abundancia del área objetivo, se pudo obtener la información de clasificación y abundancia de especies, estructura de la población, evolución filogenética y comparación de comunidades de muestras ambientales.

¿Cómo realizar una secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS?
En resumen, los pasos principales de la secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS incluyen la construcción de bibliotecas, la secuenciación y el análisis bioinformático.

    : Recomendamos el método de construcción de la biblioteca de cebadores de fusión, es decir, los cebadores fusionados con los cebadores de la secuencia diana y el adaptador, el índice y otras secuencias se sintetizan de antemano, luego las dianas de ADN genómico se amplifican directamente mediante PCR. Las bibliotecas de amplicones se purifican y se prepara una combinación equimolar de las bibliotecas de amplicones. La dilución requerida para la preparación de la plantilla se determina y se sigue por secuenciación.
  • Secuenciación: Las plataformas de secuenciación actuales incluyen principalmente Illumina Miseq / HiSeq y la plataforma de secuenciación de tercera generación.
    • Illumina NGS (MiSeq / HiSeq2500 / HiSeq4000): debido a la limitación de la longitud de lectura, la plataforma NGS solo puede seleccionar una región variable única, regiones variables dobles o regiones variables triples como regiones objetivo para la secuenciación. Al secuenciar, solo las lecturas (etiquetas) completamente secuenciadas se pueden usar para análisis adicionales, por lo que las diferentes regiones de amplificación deben seguir estrictamente la estrategia de secuenciación correspondiente. Por ejemplo, si elige V4 para el análisis, se necesita la secuenciación PE250, pero para las regiones V1-V3, la estrategia de secuenciación debe ser PE300. Solo así se puede garantizar la integridad de las secuencias. Los datos originales se filtran para eliminar las lecturas de baja calidad y dejar datos limpios de alta calidad para un análisis posterior.
    • Secuenciación PacBio SMRT: A diferencia de NGS, la plataforma de secuenciación de tercera generación puede llevar a cabo una secuenciación completa para 16S / 18S / ITS, y la tasa de alineación de secuencia y la tasa de precisión de identificación son más altas que las de NGS.

    Las unidades taxonómicas operativas (OTU) se utilizan a menudo para clasificar grupos de individuos estrechamente relacionados. En general, si la similitud de diferentes secuencias de 16S rDNA / 18S rDNA / ITS es superior al 97%, esas secuencias se pueden definir como una OTU. Cada OTU corresponde a una secuencia diferente de 16S rDNA / 18S rDNA / ITS, es decir, cada OTU corresponde a una especie. Mediante el análisis de OTU, se puede conocer la diversidad microbiana y la abundancia de diferentes microorganismos en la muestra.

    Luego, con base en los resultados de anotaciones de especies y OTU, se llevan a cabo análisis de complejidad de especies de muestra y análisis de diferencias de especies. También se proporcionan análisis basados ​​en especies, análisis del tamaño del efecto de LDA y más análisis.


    Fig.4 El flujo de trabajo de la secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS

    En CD Genomics, nuestro equipo de expertos con amplia experiencia puede ayudarlo a comprender completamente las comunidades microbianas y aprovecharlas. Además de la secuenciación de amplicones 16S / 18S / ITS, también ofrecemos otros servicios de genómica microbiana, que incluyen:

    1. Michelsen, C. F., Pedas, P., Glaring, M. A., Schjoerring, J. K., & Stougaard, P. (2014) ‘Bacterial diversity in greenlandic soils as affected by potato cropping and inorganic versus organic fertilization’, Polar Biology, 37(1), 61-71.
    2. Edwards, J., Johnson, C., Santosmedellín, C., Lurie, E., Podishetty, N. K., & Bhatnagar, S., et al. (2015) ‘Structure, variation, and assembly of the root-associated microbiomes of rice’, Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América, 112(8), E911.
    3. Evans, C. C., Lepard, K. J., Kwak, J. W., Stancukas, M. C., Laskowski, S., & Dougherty, J., et al. (2014) ‘Exercise prevents weight gain and alters the gut microbiota in a mouse model of high fat diet-induced obesity’, Plos One, 9(3), e92193.
    4. Shehab, N., Li, D., Amy, G. L., Logan, B. E., & Saikaly, P. E. (2013) ‘Characterization of bacterial and archaeal communities in air-cathode microbial fuel cells, open circuit and sealed-off reactors’, Appl Microbiol Biotechnol, 97(22), 9885-9895.
    5. Man, K. C., Au, C. H., Chu, K. H., Kwan, H. S., & Chong, K. W. (2010) ‘Composition and genetic diversity of picoeukaryotes in subtropical coastal waters as revealed by 454 pyrosequencing’, Isme Journal, 4(8), 1053.
    6. Lie, A. A. Y., Liu, Z., Hu, S. K., Jones, A. C., Kim, D. Y., & Countway, P. D., et al. (2014) ‘Investigating microbial eukaryotic diversity from a global census: insights from a comparison of pyrotag and full-length sequences of 18s rrna genes’, Appl Environ Microbiol, 80(14), 4363-4373.
    7. Lu, L., Yin, S., Liu, X., Zhang, W., Gu, T., & Shen, Q., et al. (2013) ‘Fungal networks in yield-invigorating and -debilitating soils induced by prolonged potato monoculture’, Biología del suelo y bioquímica, 65, 186-194.
    8. Orgiazzi, A., Lumini, E., Nilsson, R. H., Girlanda, M., Vizzini, A., & Bonfante, P., et al. (2012) ‘Unravelling soil fungal communities from different mediterranean land-use backgrounds’, Plos One, 7(4), e34847.
    9. Lakshmanan, V., Ray, P., & Craven, K. D. (2017) ‘Rhizosphere sampling protocols for microbiome (16s/18s/its rrna) library preparation and enrichment for the isolation of drought tolerance-promoting microbes’, Methods Mol Biol, 1631, 349-362.

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