Información

Reversión de la reticulación en ChIP-seq

Reversión de la reticulación en ChIP-seq


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) es un tipo de técnica experimental de inmunoprecipitación que se utiliza para investigar la interacción entre las proteínas y el ADN en la célula. Un resumen del protocolo para ChIP está aquí. Brevemente, los pasos son:

  1. El ADN y las proteínas asociadas de la cromatina en células o tejidos vivos están reticulados;
  2. Los complejos de ADN-proteína se cortan en fragmentos de ADN de ~ 500 pb mediante sonicación o digestión con nucleasas;
  3. Los fragmentos de ADN entrecruzados asociados con la (s) proteína (s) de interés se inmunoprecipitan selectivamente a partir de los restos celulares usando un anticuerpo específico de proteína apropiado;
  4. Los fragmentos de ADN asociados se purifican y se determina su secuencia.

Después del paso 3 (inmunoprecipitación del complejo proteína-ADN), tengo entendido que el entrecruzamiento proteína-ADN se invierte y las proteínas se eliminan mediante digestión con proteinasa K.

¿Alguien puede decirme si durante este paso el ADN en el sitio de entrecruzamiento se incluye en el paso de secuenciación adicional o se elimina con la proteína en sí?


Después del paso de inversión de la reticulación, todavía tiene algo de ADN conectado a fragmentos de proteínas.

Entonces, en ese paso, en lugar de hacer una purificación normal del ADN, también necesitamos usar una extracción con fenol-cloroformo o columnas especiales para separar el ADN de los fragmentos de proteína.

Thermofisher también suele dar muy buenas explicaciones.

Por favor, avíseme si no entendí la pregunta correctamente. :)


Reticulación inversa en el kit Active Motif: ¿solo 15 minutos? - (08 / mar / 2010)

Estoy usando el kit magnético Active Motif ChIP-IT Express para experimentos con chips. El protocolo dice que la reticulación inversa se realiza a 95 ° C durante 15 minutos o 65 ° C durante 2,5 horas, seguida de un tratamiento con proteinasa K a 37 ° C durante 1 hora. Sin embargo, he leído que la mayoría de los protocolos en otros lugares dicen cualquier cosa entre 4-6 horas o durante la noche a 65 ° C para la reticulación inversa. ¿Alguien sabe si este protocolo está bien, o debería simplemente ignorarlo y optar por una reticulación inversa más larga de todos modos? Tuve algunos resultados de PCR extraños y pensé que tal vez la reversión incompleta de los enlaces cruzados podría ser un problema. Gracias.

Revertimos X-link durante 15 minutos a 95 grados o 5 horas a 65. No veo ninguna diferencia con ninguno de los métodos. No estoy seguro acerca de solo 2.5 ha 65, eso puede no ser suficiente. Cuando veo resultados extraños en mis PCR, generalmente se debe a la presencia de inhibidores en la muestra, diluir 1/10 ayuda.

annabellak el 9 de marzo de 2010, 12 & # 5848 AM dijo:

¿Puede decirme qué inhibidores de proteinasa usa y en qué concentración?
También estoy usando el kit ActiveMotif y hago 5ul de PIC y PMSF por 1ml.

ezz el 19 de marzo de 2010, 02 & # 5827 PM dijo:

annabellak el 9 de marzo de 2010, 12 & # 5848 AM dijo:

¿Puede decirme qué inhibidores de proteinasa usa y en qué concentración?
También estoy usando el kit ActiveMotif y hago 5ul de PIC y PMSF por 1ml.

Solo una actualización rápida sobre esto para cualquiera que pueda estar haciendo una reticulación inversa de 15 minutos a 95 ° C:

Realizamos reticulación inversa de muestras de entrada (cromatina cizallada) a 95 ° C durante 15 minutos y 65 ° C durante 2, 4 y 6 horas. Esto fue analizado por qPCR, y aunque no hubo diferencia entre las muestras de 65 ° C, todas tenían Cts aproximadamente un ciclo más bajo que la muestra de 95 ° C. Teniendo en cuenta que esta fue solo la muestra de entrada, este efecto podría ser diferente en el ADN de ChIP.

A partir de ahora estaré haciendo al menos un tratamiento de 2 horas a 65 ° C.

jamessmith01 el 24 de marzo de 2010, 08 & # 5850 AM dijo:

Solo una actualización rápida sobre esto para cualquiera que pueda estar haciendo una reticulación inversa de 15 minutos a 95 ° C:

Realizamos reticulación inversa de muestras de entrada (cromatina cizallada) a 95 ° C durante 15 minutos y 65 ° C durante 2, 4 y 6 horas. Esto fue analizado por qPCR, y aunque no hubo diferencia entre las muestras de 65 ° C, todas tenían Cts aproximadamente un ciclo más bajo que la muestra de 95 ° C. Teniendo en cuenta que esta era solo la muestra de entrada, este efecto podría ser diferente en el ADN de ChIP.

A partir de ahora estaré haciendo al menos un tratamiento de 2 horas a 65 ° C.

El 95C durante 15 minutos se realiza mejor a un pH básico. Si su tampón de elución tiene un pH de 10 o superior, debería estar bien. Por debajo de este pH, el ADN se cortará y no será una plantilla tan buena para la PCR (o puede degradarse por completo). Además, hemos descubierto que un poco de agente quelante (EDTA 1 mM) también puede ayudar a preservar el ADN a altas temperaturas.

jamessmith01 el 24 de marzo de 2010, 12 & # 5850 PM dijo:

Solo una actualización rápida sobre esto para cualquiera que pueda estar haciendo una reticulación inversa de 15 minutos a 95 ° C:

Realizamos reticulación inversa de muestras de entrada (cromatina cizallada) a 95 ° C durante 15 minutos y 65 ° C durante 2, 4 y 6 horas. Esto fue analizado por qPCR, y aunque no hubo diferencia entre las muestras de 65 ° C, todas tenían Cts aproximadamente un ciclo más bajo que la muestra de 95 ° C. Teniendo en cuenta que esta fue solo la muestra de entrada, este efecto podría ser diferente en el ADN de ChIP.

A partir de ahora estaré haciendo al menos un tratamiento de 2 horas a 65 ° C.


Solo por curiosidad, ¿normalmente invierte los enlaces cruzados solo en su búfer de elución? ¿O agrega NaCl? Por lo que vale, normalmente eluyo y trato con proteinasa K al mismo tiempo (62 ° C durante 2 horas en un horno hyb para obtener un poco de agitación según el protocolo Millipore MagnaChIP) y luego lo pongo a 95 ° C durante 10 minutos antes de la purificación. Parece que me está funcionando bastante bien últimamente desde que dejé de usar el tampón de elución de Millipore (que no me dijeron la receta) y comencé a usar el 1% SDS + 0.1M NaHCO3 más común.

Mighty Mouse el 26 de marzo de 2010, 12 & # 5842 PM dijo:

jamessmith01 el 24 de marzo de 2010, 12 & # 5850 PM dijo:

Solo una actualización rápida sobre esto para cualquiera que pueda estar haciendo una reticulación inversa de 15 minutos a 95 ° C:

Realizamos reticulación inversa de muestras de entrada (cromatina cizallada) a 95 ° C durante 15 minutos y 65 ° C durante 2, 4 y 6 horas. Esto fue analizado por qPCR, y aunque no hubo diferencia entre las muestras de 65 ° C, todas tenían Cts aproximadamente un ciclo más bajo que la muestra de 95 ° C. Teniendo en cuenta que esta fue solo la muestra de entrada, este efecto podría ser diferente en el ADN de ChIP.

A partir de ahora estaré haciendo al menos un tratamiento de 2 horas a 65 ° C.


Solo por curiosidad, ¿normalmente invierte los enlaces cruzados solo en su búfer de elución? ¿O agrega NaCl? Por lo que vale, normalmente eluyo y trato con proteinasa K al mismo tiempo (62 ° C durante 2 horas en un horno hyb para obtener un poco de agitación según el protocolo Millipore MagnaChIP) y luego lo pongo a 95 ° C durante 10 minutos antes de la purificación. Parece que me está funcionando bastante bien últimamente desde que dejé de usar el tampón de elución de Millipore (que no me dijeron la receta) y comencé a usar el 1% SDS + 0.1M NaHCO3 más común.

Sigo el protocolo Active Motif de la siguiente manera:

- Realizar lavados.
- Añadir tampón de elución (& # 39AM2 & # 39), incubación de 15 min.
- Agregar búfer de enlace X inverso, eliminar supnt. de cuentas.
- Incube 15 min a 95 ° C (o 2,5 horas a 65 ° C).
- Agregar proteinasa K, incubar 1 hora a 37 ° C.
- Añada solución de parada de proteinasa K.

Supuse que el búfer de enlace X inverso contiene NaCl, pero ¿tal vez no?


¿Cómo se revierte la reticulación del formaldehído? - (19 / Oct / 2005)

Hola,
Estoy teniendo dificultades para encontrar un protocolo para la reversión de la reticulación de formaldehído. Estoy examinando la interacción entre la proteína cruda y una secuencia específica de ADN, me gustaría reticularlas, sin embargo, también necesito separarlas. Si alguien sabe de un protocolo & quot; reversible & quot; por favor, hágamelo saber.
Gracias

La reticulación de formaldehído se invierte incubando la solución reticulada en alto contenido de sal (aproximadamente 1 ul de NaCl 5 M / 25 ul de material reticulado en el kit de chips del norte del estado) a 65 ° C durante al menos 4 h

--alguien más debería confirmar esto, pero creo que esto se invierte bonos imino formado entre el factor de transcripción y el ADN por el formaldehído--

Sí, beccaf22 tiene razón. Realice la reticulación inversa POR LO MENOS durante 4 horas.

La reticulación de formaldehído se invierte incubando la solución reticulada en alto contenido de sal (aproximadamente 1 ul de NaCl 5 M / 25 ul de material reticulado-kit de chips del norte del estado) a 65 ° C durante al menos 4 h

--alguien más debería confirmar esto, pero creo que esto se invierte bonos imino formado entre el factor de transcripción y el ADN por el formaldehído--


Reticulación e inmunoprecipitación UV (CLIP)

El interés en las interacciones ARN-proteína está en auge a medida que comenzamos a apreciar el papel del ARN, no solo en procesos bien establecidos como la transcripción, el empalme y la traducción, sino también en campos más nuevos como la interferencia del ARN y la regulación génica por no codificación. ARN.

CLIP es una técnica basada en anticuerpos que se utiliza para estudiar las interacciones ARN-proteína relacionadas con la inmunoprecipitación de ARN (RIP), pero difiere de RIP en el uso de radiación UV para entrecruzar proteínas de unión de ARN al ARN al que están unidas. Este enlace covalente es irreversible, lo que permite condiciones de purificación estrictas. A diferencia de RIP, CLIP proporciona información sobre el sitio de unión de proteínas real en el ARN.

Existen diferentes tipos de CLIP, CLIP de secuenciación de alto rendimiento (HITS-CLIP), CLIP mejorado con ribonucleósidos fotoactivables (PAR-CLIP) y CLIP individual (iCLIP).

Aquí hay un resumen del protocolo iCLIP adaptado de Konig et al. J. Vis. Exp. 2011. “iCLIP: mapeo de interacciones proteína-ARN en todo el transcriptoma con resolución individual de nucleótidos”.

Más adaptado de Huppertz et al. Métodos. 2014. "iCLIP: interacciones proteína-ARN en la resolución de nucleótidos".

Tampón de lisis

Inhibidores de proteasa (agregar nuevos cada vez)

Lavado con alto contenido de sal

Dilución baja de ARNasa Dilución alta de ARNasa

Diluciones 1/500 de ARNasa I para la preparación de bibliotecas Diluciones 1/50 de ARNasa I para controlar el anticuerpo

Mezcla de tampón de lavado PNK

4 μL 5x PNK tampón pH 6,5 [Tris-HCl 350 mM, pH 6,5 MgCl 50 mM 2 Ditiotreitol 5 mM]

Mezcla de ligadura Una mezcla PNK caliente

4 μL de tampón de ligación 4x [Tris-HCl 200 mM MgCl 40 mM 2 Ditiotreitol 4 mM]

1,5 μL de enlazador L3 pre-adenilado [20 μM]

Tampón PK Tampón PKurea

Mezcla de ARN / cebador mezcla RT

Cebador Rclip de 0,5 μL [0,5 pmol / μL]

0,25 μL de transcriptasa inversa Superscript III

Mezcla de ligadura B Mezcla de recocido oligo

0.8 μL 10x CircLigase Buffer II

1 μL de mezcla de imprimación P5 / P3 solexa

20 μl de enzima Accuprime Supermix 1

1. Reticulación UV de células de cultivo de tejidos

1.1. Retire el medio y agregue PBS helado a las células (por ejemplo, use células cultivadas en una placa de 10 cm para tres experimentos y agregue 6 ml de PBS).

1.2. Retirar la tapa, colocar sobre hielo e irradiar una vez con 150 mJ / cm 2 a 254 nm utilizando un Stratalinker.

Se deben mantener uno o más controles negativos durante todo el experimento. Las células o tejido knockout, así como las células no reticuladas, son buenos controles negativos, mientras que no se recomiendan las células knockout.

Nota. La preincubación opcional con 4-tiouridina y la reticulación con UV-A podrían usarse para ciertas proteínas. La 4-tiouridina mejora la reticulación de algunas proteínas. (Para este paso opcional, siga las instrucciones a continuación).

Opcional: etiquetado con tiouridina y reticulación UV-A (alternativa al paso 1.2)

• Añada 50 μL de 4SU (concentración de stock: 4SU 100 mM) a una placa de 10 cm de células cultivadas en 10 ml de DMEM suplementado con FBS y estreptococo para obtener una concentración final de 4SU 500 μM. Alternativamente, agregue 10 μL de 4-tiouridina (concentración de stock: 100 mM) para obtener una concentración final de 100 μM 4SU.

• Incubar las células con 4-tiouridina durante 60 min a 500 μM u 8 ha 100 mM. Verifique la viabilidad celular.

• Aspire el medio y agregue 6 mL de PBS helado a las células que crecen en una placa de 10 cm (suficiente para tres inmunoprecipitaciones). Retirar la tapa y colocar sobre hielo.

• Irradiar una vez con 2 × 400 mJ / cm 2 en un Stratalinker 2400 con focos de 365 nm o un instrumento equivalente.

1.3. Coseche las células con un raspador de células y transfiera la suspensión de células a microtubos (por ejemplo, 2 ml a cada uno de los tres microtubos).

1.4. sedimentar las células (centrifugar a la velocidad máxima durante 10 segundos a 4 ° C), luego eliminar el sobrenadante.

1.5. Congele los sedimentos celulares en hielo seco y almacénelos a -80 ° C hasta su uso.

El experimento puede durar hasta una semana. Evite múltiples ciclos de congelación y descongelación.

1.6 Preparación de perlas

1.6.1 Añadir perlas de proteína A o proteína G (por ejemplo, 100 μl de perlas magnéticas por experimento) a un microtubo nuevo y lavar las perlas 2 veces con tampón de lisis.

1.6.2 Resuspenda las perlas en tampón de lisis (100 μL), agregue anticuerpo (2-10 μg) y gire los tubos a temperatura ambiente durante 30-60 min.

Es posible que deba optimizarse la cantidad de anticuerpo necesaria. Una muestra sin anticuerpos es un buen control negativo.

1.6.3. Lave las perlas 3 veces con tampón de lisis (900 μL) y déjelas en el último lavado hasta que esté listo para proceder con la inmunoprecipitación (paso 3.1).

Si un anticuerpo funciona en IP, es una buena indicación de que funcionará en CLIP.

2. Lisis celular y digestión del ARN partail

2.1. Resuspender el sedimento celular en tampón de lisis con inhibidores de proteasa (1 ml) y transferir a microtubos de 1,5 ml.

Nota. Aquí puede probar un paso de sonicación opcional. La sonicación corta el ADN, que libera proteínas de la cromatina aumentando la recuperación de los complejos proteína-ARN.

Opcional: sonicación de muestras

Sonique la muestra en hielo usando un sonicador de sonda. La sonda no debe tocar los lados del tubo para evitar la formación de espuma. Sonicar dos veces con ráfagas de 10 segundos a cinco decibeles. Limpiar la sonda sonicando H 2 O antes y después del tratamiento de la muestra.

Use Bioruptor plus durante cinco ciclos alternando 30 segundos encendido / 30 segundos apagado a baja intensidad.

2.2. Agregue una dilución baja de RNasa (10 μL) y Turbo DNasa (2 μL) al lisado celular e incube durante exactamente 3 min a 37 ° C, agitando a 1100 rpm, luego transfiéralo inmediatamente a hielo.

2.3. Girar a 4 ° C a 22.000 g durante 10 min y recoger cuidadosamente el sobrenadante aclarado (dejar aproximadamente 50 μL de lisado con el sedimento).

Cada miembro del laboratorio debe utilizar su propio conjunto de tampones y reactivos para identificar más fácilmente las posibles fuentes de contaminación. Es posible que sea necesario optimizar las condiciones ideales para las digestiones de RNasa para cada nuevo lote de RNasa.

3. Inmunoprecipitación y desfosforilación de los extremos 3 'del ARN

3.1. Retire el tampón de lisis de las perlas (paso 1.1.3) y agregue el lisado celular (del paso 2.3).

3.2. Gire las muestras durante 2 ha 4 ° C.

3.3. Desechar el sobrenadante, lavar las perlas 2 veces con tampón con alto contenido de sal (900 μl) y luego 2 veces con tampón de lavado (900 μl). Rote estos lavados durante al menos 1 minuto a 4 ° C.

La optimización y las estrictas condiciones de lavado son muy importantes.

Nota. En el caso de que las condiciones de iCLIP estándar no sean lo suficientemente estrictas para purificar específicamente la proteína de interés, se puede usar una inmunoprecipitación dual con desnaturalización de urea en lugar del protocolo descrito aquí. Para obtener más información, consulte Huppertz et al. Métodos. 2014. "iCLIP: interacciones proteína-ARN en la resolución de nucleótidos".

3.4. Desechar el sobrenadante, resuspender las perlas en la mezcla PNK (20 μL) e incubar durante 20 min a 37 ° C en un termomezclador.

3.5. Añadir tampón de lavado (500 μL), lavar 1x con tampón con alto contenido de sal y luego 2x con tampón de lavado.

4. Ligadura del enlazador a los extremos 3 'del ARN y etiquetado del extremo 5' del ARN

4.1. Retire con cuidado el sobrenadante, resuspenda las perlas en la mezcla de ligadura A (20 μL) e incube durante la noche a 16 ° C en un termomezclador.

4.2. Añadir tampón de lavado (500 μL), lavar 2 veces con tampón de alto contenido de sal (1 ml) y luego 2 veces con tampón de lavado (1 ml). Realizar estos lavados con rotación a 4 ° C durante 5 min cada uno.

4.3. Retirar el sobrenadante, resuspender las perlas en mezcla PNK caliente (4 μl) e incubar durante 5 min a 37 ° C.

4.4. Retire la mezcla PNK caliente y resuspenda las perlas en tampón de carga 1x SDS-PAGE (20 μL).

4.5. Incubar en un termomezclador a 70 ° C durante 10 min.

4.6. Coloque inmediatamente sobre un imán para precipitar las perlas vacías y cargue el sobrenadante en el gel (consulte el paso 5).

5. Linker SDS-PAGE y transferencia de membrana

5.1. Cargue las muestras, así como un marcador de tamaño de proteína previamente teñido (5 μL) en un gel Bis-Tris al 4-12% prefabricado y ejecute el gel durante 50 min a 180 V en tampón de ejecución 1x MOPS (de acuerdo con las instrucciones del fabricante).

Se recomiendan geles con pH 7 constante.

5.2. Retire el frente del gel y deséchelo como residuo sólido (contiene ATP radiactivo libre).

5.3. Transfiera los complejos de proteína-ARN del gel a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia en húmedo (transfiera 1 ha 30 V según las instrucciones del fabricante).

5.4. Después de la transferencia, enjuague la membrana en tampón PBS, luego envuélvala en film transparente y expóngala a una película a -80 ° C durante 30 min, 1h y luego durante la noche.

Una pegatina fluorescente junto a la membrana permite posteriormente alinear la película y la membrana. El éxito del experimento se puede controlar en la autorradiografía del complejo proteína-ARN después de la transferencia de membrana.


¿Cómo probar la reticulación y la reversión de ChIP? - (13 / Jun / 2006)

También me gustaría probar su nuevo protocolo para ChIP. ¿Es posible que me envíe el protocolo o una reimpresión del artículo en los protocolos de la naturaleza ya que no tenemos acceso a esta revista?

Me preguntaba qué tan bien / si este método de chip rápido podría ajustarse para usar columnas de giro (en lugar de pipetear el sobrenadante, simplemente girando.

¿Quieres decir, simplemente cargar las cuentas y todo en una columna giratoria y hacer girar el supe? Recuerdo vagamente haber escuchado sobre alguien que hizo esto y tuvo éxito, pero desafortunadamente no puedo recordar dónde. ¿Le preocupa el arrastre de perlas durante la transferencia de la muestra, la gran cantidad de volumen muerto o simplemente está tratando de acelerar el ensayo?

En realidad, quiero reducirlo de manera que el & # 39pellet & # 39 sea demasiado pequeño para distinguirlo. Además, mis habilidades de recuperación del sobrenadante no son excelentes (parece demasiada variabilidad). Lo acabo de probar, así que veremos cómo se ven los PCR.

EDITAR: Bueno, no hubo suerte. Pero no la mala suerte que pensaba que sucedería. Las muestras de anticuerpo (dos abs diferentes), sin anticuerpo e IgG muestran una señal de PCR. ¿Que demonios? Cualquier ayuda aquí. Al menos la primera vez que hubo más señal en las dos muestras de anticuerpos que en la muestra sin ab, ahora todas son aproximadamente iguales. Incluso intenté lavar con una concentración de sal más alta (450 mM) en el tampón esta vez. ¿ALGUNA AYUDA EXISTE?

¿Quieres decir, simplemente cargar las cuentas y todo en una columna giratoria y hacer girar el supe? Recuerdo vagamente haber oído hablar de alguien que hizo esto y tuvo éxito, pero desafortunadamente no puedo recordar dónde. ¿Le preocupa el arrastre de perlas durante la transferencia de la muestra, la gran cantidad de volumen muerto o simplemente está tratando de acelerar el ensayo?

En realidad, quiero reducirlo de manera que el & # 39pellet & # 39 sea demasiado pequeño para distinguirlo. Además, mis habilidades de recuperación del sobrenadante no son excelentes (parece demasiada variabilidad). Lo acabo de probar, así que veremos cómo se ven los PCR.

EDITAR: Bueno, sin suerte. Pero no la mala suerte que pensaba que sucedería. Las muestras de anticuerpo (dos abs diferentes), sin anticuerpo e IgG muestran una señal de PCR. ¿Que demonios? Cualquier ayuda aquí. Al menos la primera vez que hubo más señal en las dos muestras de anticuerpos que en la muestra sin ab, ahora todas son aproximadamente iguales. Incluso intenté lavar con una concentración de sal más alta (450 mM) en el tampón esta vez. ¿ALGUNA AYUDA EXISTE?

¿Quieres decir, simplemente cargar las cuentas y todo en una columna giratoria y hacer girar el supe? Recuerdo vagamente haber oído hablar de alguien que hizo esto y tuvo éxito, pero desafortunadamente no puedo recordar dónde. ¿Le preocupa el arrastre de perlas durante la transferencia de la muestra, la gran cantidad de volumen muerto o simplemente está tratando de acelerar el ensayo?

Después de la incubación del anticuerpo con la cromatina, ¿centrifugó (10 minutos de velocidad máxima, al menos) y tuvo cuidado de tomar solo el 85-90% superior (o menos) al transferir la cromatina a las perlas de proteína A?

Bueno, lo hice a través de una columna, así que lo hice girar y recogí el flujo. Estoy a punto de volver a hacerlo sin las columnas, pero esta vez limpiando previamente mis muestras con algunas cuentas. Tal vez eso elimine la señal pcr en las muestras no ab & # 33 También vi que se sugirió bloquear las cuentas con BSA. ¿Cuál crees que funcionaría mejor (o ambos)?

Puede intentar incubar sus cuentas con 5% de BSA y 100 ug / ml de ADN de esperma de salmón cortado antes y durante la incubación con anticuerpo y cromatina. Esto puede ayudar a reducir la unión no específica. Además, si está usando perlas de alta capacidad (como la agarosa de proteína A de flujo rápido de Amersham), puede reducir la cantidad de perlas que usa.

Reduciría la cantidad de perlas, pero ¿como es el principal (nuevo) problema que estoy teniendo es la desaparición de las perlas de agarosa? Hago girar tubos que solo tenían un gránulo (todo lo que hice fue agregar mi muestra ab incubada) pero después de girar ya no veo un gránulo ¿Alguna idea?

Puede intentar incubar sus cuentas con 5% de BSA y 100 ug / ml de ADN de esperma de salmón cortado antes y durante la incubación con anticuerpo y cromatina. Esto puede ayudar a reducir la unión no específica. Además, si está utilizando perlas de alta capacidad (como la agarosa de proteína A de flujo rápido de Amersham), puede reducir la cantidad de perlas que usa.


¿Cuáles son los problemas técnicos con ChIP-seq?

En términos generales, ChIP-seq tiene tres pasos clave que determinan su éxito. La primera y más crucial es la selección de anticuerpos, la segunda es la secuenciación real, que está sujeta a varios posibles sesgos y la tercera es el análisis algorítmico, que incluye el mapeo y la llamada de picos.

El primer requisito, obviamente, es que el anticuerpo tenga alguna especificidad para la proteína en estudio: esto se puede probar usando un panel de proteínas recombinantes o líneas celulares transfectadas con diferentes dianas proteicas. Entonces, el anticuerpo debe poder inmunoprecipitar la proteína diana. No todos los anticuerpos inmunoprecipitan, e incluso cuando lo hacen, es posible que no les vaya bien en ChIP. Idealmente, los estudios anteriores habrán identificado sitios genómicos donde se sabe que la proteína se une, y estos sitios pueden usarse para optimizar las condiciones de ChIP.

El segundo problema es la secuenciación, que es una "caja negra" para muchos biólogos, que están familiarizados con lo que entra y sale, pero quizás no con los posibles sesgos introducidos en el medio. Los enfoques de secuenciación de próxima generación requieren un procesamiento masivo de fragmentos de ADN y una secuenciación masivamente paralela. Esto significa que incluso el más mínimo sesgo en la ligadura de enlazadores, en la amplificación por PCR o en la hibridación podría dar lugar a algunos sesgos dependientes de la plataforma en los datos de población que surgen de 10 millones o más de lecturas. Las tecnologías aún están evolucionando y los diferentes formatos tienen diferentes sesgos. Por esta razón, es importante en un experimento de ChIP-seq ejecutar un control utilizando 'ADN de entrada' (ADN genómico que no es de ChIP) para que los sesgos de secuenciación puedan identificarse y ajustarse.

El tercer problema es el mapeo, que con etiquetas cortas (alrededor de 25 a 35 pb) puede ser ambiguo en regiones de alta homología o en regiones repetidas. A medida que las secuencias de etiquetas se alargan, esto es un problema menor, pero los errores de secuenciación y llamadas de base limitan la capacidad de asignación. No es raro tener solo el 50% de las lecturas asignables, aunque con algoritmos de mapeo más 'inteligentes' que tienen en cuenta los errores de secuenciación o polimorfismos, la mapeo ha aumentado significativamente. En ChIP-seq, la densidad de las etiquetas de secuencia mapeadas es un determinante principal del éxito. El algoritmo ELAND de Illumina y MAQ (Mapeo y ensamblaje con calidad) solían ser los mapeadores de lectura corta preferidos, pero una nueva generación de programas más eficientes como Bowtie, BWA (Burrows-Wheeler Alignment Tool) y BFAST (Blat-like) Herramienta de búsqueda rápida y precisa) los están reemplazando gradualmente.


Conclusiones

Proporcionamos un protocolo para ChIP-exo basado en la plataforma de secuenciación Illumina de uso común. Como ChIP-seq proporcionó una mejora sustancial sobre ChIP-chip en la precisión de la llamada de picos y la capacidad de distinguir los sitios de enlace cercanos [3, 15], nuestros datos sugieren firmemente que ChIP-exo supera a ChIP-seq en la capacidad de discriminar picos cercanos y pequeños picos. Además, puede revelar conocimientos sobre los patrones de unión del factor de transcripción al ADN, incluida la predicción de la unión del dímero del factor de transcripción. También mostramos por primera vez que ChIP-exo es factible en tejidos primarios como el hígado de ratón. Creemos que la tecnología ChIP-exo puede ayudar a caracterizar la arquitectura del cis-Elementos reguladores, particularmente en lo que respecta a resaltar la cooperatividad entre factores de transcripción.

Disponibilidad de datos

Todos los datos se depositan en ArrayExpress con el número de acceso E-MTAB-1827. La Figura 3A incluye datos de ratón FoxA1 ChIP-seq depositados bajo los números de acceso de ArrayExpress E-MTAB-223 [8] y E-MTAB-1414 [16].


Preparación de bibliotecas ChIP-seq sin ligaduras y de baja entrada con tecnología de cambio de plantillas

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) seguida de secuenciación de alto rendimiento (ChIP-seq) se ha convertido en el estándar de oro para el mapeo de factores de transcripción y modificaciones de histonas en todo el genoma. Sin embargo, para los experimentos de ChIP que involucran pocas células o que se dirigen a factores de transcripción de baja abundancia, la pequeña cantidad de ADN recuperado hace que la ligadura de adaptadores sea muy desafiante. En esta unidad, describimos un flujo de trabajo de ChIP-seq que se puede aplicar a números de células pequeñas, incluido un método robusto de un solo tubo y sin ligadura para la preparación de bibliotecas de secuenciación a partir de cantidades de sub-nanogramos de ADN de ChIP. Primero se presenta un ejemplo de protocolo de ChIP, que da como resultado un enriquecimiento selectivo de proteínas de unión al ADN y fragmentos de ADN reticulados inmovilizados en perlas a través de un puente de anticuerpos. A esto le sigue un protocolo para la recuperación de ADN y la reversión de la reticulación rápida y sencilla. Por último, describimos un protocolo de preparación de bibliotecas rápido y sin ligaduras, con tecnología DNA SMART, que da como resultado muestras listas para la secuenciación de Illumina. © 2016 por John Wiley & Sons, Inc.


Cromodinámica biológica: un método general para medir la ocupación de proteínas en el genoma mediante la calibración de ChIP-seq

La secuenciación de fragmentos de ADN asociados con proteínas tras la reticulación in vivo con formaldehído (conocido como ChIP-seq) se ha utilizado ampliamente para describir la distribución de proteínas a través de genomas. No se aprecia ampliamente que este método simplemente estima la distribución de una proteína y no puede revelar cambios en la ocupación entre muestras. Para hacer esto, marcamos con el mismo epítopo proteínas ortólogas en Saccharomyces cerevisiae y Candida glabrata, cuyas secuencias han divergido hasta el punto de que la mayoría de los fragmentos de ADN de más de 50 pb son exclusivos de una sola especie. Mezclando números definidos de células de C. glabrata (el genoma de calibración) con muestras de S. cerevisiae (los genomas experimentales) antes de la fragmentación de cromatina y la inmunoprecipitación, es posible derivar una medida cuantitativa de ocupación (el índice de ocupación - OR) que permite una comparación de ocupaciones no solo dentro sino también entre genomas. Demostramos por primera vez que este método de calibración de 'estándar interno' satisface la condición sine qua non para cuantificar los perfiles de ChIP-seq, es decir, la linealidad en un amplio rango. Fundamentalmente, al emplear proteínas etiquetadas funcionales, nuestro proceso de calibración describe un método que distingue la asociación genuina dentro de los perfiles de ChIP-seq del ruido de fondo. Nuestro método es aplicable a cualquier proteína, no simplemente a las altamente conservadas, y evita la necesidad de cuantificar el ChIP, que requiere mucho tiempo, es costoso y técnicamente exigente, utilizando qPCR, que solo se puede realizar en loci individuales. Como demostramos por primera vez en este artículo, el ChIP-seq calibrado representa un paso importante hacia la documentación de las distribuciones cuantitativas de proteínas a lo largo de los cromosomas en diferentes estados celulares, que denominamos cromodinámica biológica.

© The Author (s) 2015. Publicado por Oxford University Press en nombre de Nucleic Acids Research.

Cifras

Los perfiles de ChIP-seq no se ven afectados por ...

Los perfiles de ChIP-seq no se ven afectados por las celdas de referencia. Extractos crudos preparados a partir de ...

El índice de ocupación (OR) no se ve afectado ...

El índice de ocupación (OR) no se ve afectado por la cantidad de celdas de referencia. Experimentos de ChIP-seq ...

Usando ChIP-seq calibrado para medir ...

Usando ChIP-seq calibrado para medir la asociación dependiente del ciclo celular de la cohesina con el S.…

Perfiles ChIP-seq convencionales de cohesin ...

Perfiles ChIP-seq convencionales de cohesina (Scc1) durante la sincronización S. cerevisiae ciclos celulares. Los…

Cromodinámica de cohesina: perfiles ChIP-seq calibrados ...

Cromodinámica de cohesina: perfiles de ChIP-seq calibrados de Scc1 durante la sincronización S. cerevisiae ciclos celulares. Los…

ChIP-seq calibrado a diferencia de ChIP-seq convencional ...

ChIP-seq calibrado, a diferencia del ChIP-seq convencional, distingue las señales del ruido. ( A ) Calibrado ...

Perfiles ChIP-seq calibrados de wild…

Perfiles de ChIP-seq calibrados del mutante de tipo salvaje, imitado por acetilación y mutante de hidrólisis de ATPasa Smc3.…

Dinámica de cohesina alrededor del centrómero.…

Dinámica de cohesinas alrededor del centrómero. El número de lecturas por par de bases (eje Y)…

Cohesina pericéntrica vista por calibrado ...

Cohesina pericéntrica vista por imágenes de celda y ChIP-seq calibradas. ( A ) Cohesin ...


Preguntas frecuentes sobre ChIP-seq

El kit ChIP Elute permite la elución del ADN de la proteína A / G agarosa o perlas magnéticas y la reversión de la reticulación en un solo paso. Este kit es significativamente más rápido y conveniente que los métodos tradicionales. El kit ChIP Elute tarda solo una hora (incluida la purificación del ADN), mientras que los métodos tradicionales demoran toda la noche. Dado que el ADN monocatenario (ssDNA) se produce mediante el método ChIP Elute, este método es apropiado para experimentos de ChIP seguidos de qPCR o experimentos de ChIP-seq si se utiliza un kit DNA SMART ChIP-Seq (que son totalmente compatibles con ssDNA entradas). El uso del método ChIP Elute en combinación con el kit DNA SMART ChIP-Seq hace que ChIP-seq sea menos tedioso y requiera más tiempo.

¿Los resultados de ChIP-seq son los mismos si utilizo el método estándar o el kit de elución de ChIP?

Si. Las bibliotecas de secuenciación generadas a partir de ADN eluido con el kit ChIP Elute o con métodos tradicionales muestran métricas de secuenciación comparables.

¿Debo limpiar mi ChIP DNA antes de la preparación de la biblioteca?

Si. El kit ChIP Elute incluye purificación y concentración de ADN en columna. El ADN ChIP preparado con este kit es directamente compatible con el kit DNA SMART ChIP-Seq sin necesidad de purificación adicional.

    • Si utiliza otro método para la reversión de enlaces cruzados y elución de ADN, recomendamos el kit NucleoSpin Gel y PCR Clean-Up junto con Buffer NTB (disponible por separado, n.o de cat. 740595.150), que está especialmente formulado para admitir muestras con altas concentraciones de SDS.

    Nota: Si su ADN es monocatenario, deberá utilizar Buffer NTC (n.º de cat. 740654.100) con el kit NucleoSpin Gel y PCR Clean-Up.

    Estoy usando ChIP para ver las modificaciones de histonas con solo 10,000 células. ¿Funcionarán los kits ChIP Elute y DNA SMART ChIP-Seq con una entrada tan pequeña?

    Si. Hemos analizado el ADN de los pull-downs de H3K4me3 usando 10,000 & ndash1 millones de células, usando el kit ChIP Elute al final de nuestro flujo de trabajo ChIP seguido de un kit DNA SMART ChIP-Seq. Obtuvimos un rendimiento razonable de 10,000 células usando 18 ciclos de PCR.

    ¿Necesito tratar mis muestras con RNase antes de la preparación de la biblioteca?

    No. Las RNasas residuales en la muestra pueden comprometer el éxito de la preparación de la biblioteca. Además, la desoxinucleotidil transferasa terminal no usará ARN como plantilla en el paso de cola T, y el uso de un cebador poli (dA), en lugar de un cebador poli (dT), hace que el cebado para ARN sea poco probable.

    ¿Qué tamaño de fragmentos puede alojar el kit DNA SMART ChIP-Seq?

    Los fragmentos de ADN de más de 100 pb se pueden utilizar con el kit DNA SMART ChIP-Seq. If desired, fragments several kb in length can easily be amplified however, this kit has been tested specifically with ChIP DNA fragments ranging from 100 to 500 bp (with an average of 200&ndash400 bp). The PCR cycling guidelines in the DNA SMART ChIP-Seq User Manual are based on DNA fragments in this range. If your DNA is substantially longer or shorter, the optimal number of PCR cycles will need to be determined empirically.

    Why are size selection and cleanup not performed before the PCR step as in other kits?

    In ligation-based kits, a pre-PCR cleanup step is required to remove adapter dimers. The DNA SMART ChIP-Seq Kit does not use ligation, and high-quality ChIP-seq libraries can be obtained without size selection. However, specific applications such as identification of transcription factor binding sites may benefit from stringent size selection. We have found that pre-PCR size selection reduces the complexity of the final library, with increased PCR duplicates (see our tech note for more information). Our single-tube workflow allows for size selection and cleanup following the PCR step, and our protocol provides guidance for more or less stringent size selection. We have found that the basic protocol (Option 1) removes larger PCR fragments (that do not cluster well) without compromising library complexity.

    How much sequence is added to my samples in the final library?

    Together, the DNA SMART Oligo, DNA SMART Poly(dA) Primer, and the Indexing Primers for Illumina add 153 bp to the initial DNA fragment length.

    Why don’t I see anything when I run the libraries on an agarose gel?

    We do not recommend running the final libraries on an agarose gel. To minimize biases, ChIP-seq libraries (as well as other types of next-generation sequencing libraries) should not be overamplified. The low concentration of the final library makes visualization on agarose gels very difficult. Instead, we recommend quantifying the libraries with a Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) with the Qubit dsDNA HS Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Cat. # Q32851 and Q32854). To evaluate library quality, run 1 µl of the library on an Agilent 2100 Bioanalyzer using the High Sensitivity DNA Kit (Agilent, Cat. # 5067-4626).

    Nota: For optimal resolution, if the library concentration is >2 ng/µl, dilute the library in water or Library Elution Buffer to a concentration of 1&ndash2 ng/µl prior to running on the Agilent Bioanalyzer.

    What library yield should I expect?

    Our guidelines typically result in a final library yield of >5 ng/µl (>20&ndash25 nM). Lower yield (2&ndash3 ng/µl) may be typical for very low inputs (100 pg), but is still enough for sequencing. If you obtain >25 ng/µl, consider reducing the number of cycles to minimize potential biases.

    Where are the indexes in the final ChIP-seq libraries?

    Indexed adapters for Illumina sequencing are present in the PCR primers used to amplify the ChIP-seq library. The Index 1 (i7) sequence is found on the Reverse PCR Primer HT while the Index 2 (i5) sequence is found on the Forward PCR Primer HT. When selecting settings for sequencing, HT indexes should be used. The specific sequence of the indexes on these primers is the same as the standard Illumina HT indexes, and can also be found in the DNA SMART ChIP-Seq Kit User Manual.

    Overview of template switching in the DNA SMART ChIP-Seq Kit. The Index 1 (i7) sequence (indicated in yellow) is found on the Reverse PCR Primer HT while the Index 2 (i5) sequence (indicated in pink) is found on the Forward PCR Primer HT.

    Which indexes are included in the DNA SMART ChIP-Seq kits?

    There are three versions of the DNA SMART ChIP-Seq Kit. They all contain PCR primers with indexes identical to those in the Illumina TruSeq DNA HT Sample Prep Kit. Forward PCR Primers contain the i5 index, and Reverse PCR Primers contain the i7 index.

    • The 12-reaction kit (Cat. # 634865) includes 1 forward primer (with an index identical to D502) and 12 reverse primers (with indexes identical to D701&ndashD712)
    • The 48-reaction kit A (Cat. # 634866) includes 4 forward primers (with indexes identical to D501&ndashD504) and 12 reverse primers (with indexes identical to D701&ndashD712)
    • The 48-reaction kit B (Cat. # 634867) includes 4 forward primers (with indexes identical to D505&ndashD508) and 12 reverse primers (with indexes identical to D701&ndashD712)

    Together, the DNA SMART ChIP-Seq Kit - 48 A and the DNA SMART ChIP-Seq Kit - 48 B can be used to generate libraries incorporating all 96 high-throughput Illumina indexes. The nucleotide sequences for the indexes can be found in the DNA SMART ChIP-Seq Kit User Manual.

    How many samples can I multiplex per run?

    ChIP-seq libraries generated with the DNA SMART ChIP-Seq Kit contain adapters and indexes for Illumina sequencing. There are three versions of this kit that allow production of either 12 or 48 indexed libraries. It is also possible to use both versions of the 48-reaction kit (the DNA SMART ChIP-Seq Kit - 48 A and B) to generate the full 96 high-throughput Illumina indexes. Not all indexes can be pooled together consult the Illumina literature (such as the "TruSeq ® DNA Sample Preparation Guide") for appropriate pooling guidelines. If needed, compare the index sequences in the DNA SMART ChIP-Seq Kit User Manual with Illumina adapter sequences.

    Can I do paired-end sequencing with the DNA SMART ChIP-Seq Kit?

    Single-end sequencing with Read 1 is generally sufficient for ChIP-seq. However, if paired-end sequencing is desired, you should use the DNA SMART Custom Read2 Seq Primer provided in the kit (if your sequencing facility accepts custom primers). The custom primer can be used on an Illumina MiSeq ® instrument or sent along with your samples to your sequencing facility for a HiSeq ® run.

    Do I need to trim my reads before mapping?

    You should trim three nucleotides from the 5' end of your reads (Read 1). Optionally, you may also trim Illumina adapter sequences and stretches of poly(T), particularly if you read more than 50 nucleotides, as sequences from short inserts will contain the T-tail that is added in the library construction process.

    Some of my sequences (Read 1) have a poly(T) stretch at their 3' ends: what does this mean?

    The lower limit of the AMPure bead size selection is not a perfect cutoff a small proportion of the PCR products in the final library may have short inserts. In these cases, the sequencing from Read 1 will read through the T-tail added during library synthesis.

    Takara Bio USA, Inc.
    Estados Unidos / Canadá: +1.800.662.2566 y toro Asia Pacífico: +1.650.919.7300 y toro Europa: +33. (0) 1.3904.6880 y toro Japón: +81. (0) 77.565.6999
    SOLO PARA USO EN INVESTIGACIÓN. NO DEBE UTILIZARSE EN LOS PROCEDIMIENTOS DE DIAGNÓSTICO. & copy 2021 Takara Bio Inc. Todos los derechos reservados. Todas las marcas comerciales son propiedad de Takara Bio Inc. o sus afiliadas en los EE. UU. Y / o en otros países o sus respectivos propietarios. Es posible que algunas marcas comerciales no estén registradas en todas las jurisdicciones. Información adicional sobre productos, propiedad intelectual y uso restringido está disponible en takarabio.com.

    Takara Bio Europe es miembro de Takara Bio Group, una empresa líder en ciencias de la vida que está comprometida con la mejora de la condición humana a través de la biotecnología. A través de nuestras marcas Takara, Clontech y Cellartis, nuestra misión es desarrollar herramientas y servicios innovadores de alta calidad para acelerar el descubrimiento.


    Ver el vídeo: Corneal Cross Linking CXL: 10 Pro Tips for a More Comfortable Recovery (Diciembre 2022).