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¿Cuáles son las ventajas de usar células en interfase en lugar de células en metafase para fines de mapeo de genes usando FISH?

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Me han dicho que las células en interfase son mejores para el mapeo de genes que las células en metafase, pero no sé por qué.


En metafase, los cromosomas se encuentran en su nivel más alto de condensación. FISH se basa en poder disociar las dos cadenas de ADN para aparear una sonda específica de secuencia. Entonces, supongo que es técnicamente más fácil lograr una buena tinción FISH en interfase, cuando los cromosomas están mucho menos condensados. Puede haber otras razones que no conozco (no soy genetista).


Q-FISH

Fluorescente cuantitativo en el lugar hibridación (Q-FISH) es una técnica citogenética basada en la metodología tradicional FISH. En Q-FISH, la técnica utiliza imitadores de ADN sintético marcados (Cy3 o FITC) llamados oligonucleótidos de ácido nucleico peptídico (PNA) para cuantificar las secuencias diana en el ADN cromosómico mediante microscopía fluorescente y software de análisis. Q-FISH se usa más comúnmente para estudiar la longitud de los telómeros, que en los vertebrados son secuencias hexámeras repetitivas (TTAGGG) ubicadas en el extremo distal de los cromosomas. Los telómeros son necesarios en los extremos de los cromosomas para prevenir las respuestas al daño del ADN y la inestabilidad del genoma. Hasta el día de hoy, el método Q-FISH continúa utilizándose en el campo de la investigación de los telómeros.


¿Cuáles son las ventajas de usar células en interfase en lugar de células en metafase para fines de mapeo de genes usando FISH? - biología

5. PESCADO: ventajas y desventajas

(Simone Rocco): El desarrollo de las técnicas de bandas en los años 70 supuso una primera revolución en el campo citogenético, permitiendo una definición precisa de los cromosomas y sus anomalías. El estudio de cariotipo ha aumentado nuestro conocimiento del campo de la onco-hematología, haciéndose necesario para una correcta clasificación diagnóstica. La principal limitación de la citogenética convencional es que la célula debe estar en mitosis para poder ser analizada correctamente. Además, a pesar de la presencia de métodos de alta resolución, el análisis citogenético convencional es capaz de detectar solo reordenamientos cromosómicos que afectan a más de 3 megabases (Mb). Todos estos problemas se han resuelto gracias a la introducción del Hibridación in situ por fluorescencia (FISH) a finales de los 80.

(Rachele Rosso): FISH es un tipo de técnica citogenética que utiliza sondas fluorescentes que se unen a partes del cromosoma para mostrar un alto grado de complementariedad de secuencia, y se puede utilizar para averiguar dónde se une la sonda fluorescente al cromosoma. FISH se utiliza a menudo para encontrar características específicas en el ADN y para detectar y localizar objetivos de ARN específicos (ARNm, ARNc de ln y miARN) .Esta técnica proporciona una forma novedosa para que los investigadores visualicen y mapeen el material genético en una célula individual, incluyendo genes o porciones de genes. A diferencia de la mayoría de las otras técnicas utilizadas para el estudio de los cromosomas, FISH no necesita realizarse en células que se están dividiendo activamente, lo que lo convierte en un procedimiento muy versátil. Está compuesto por 4 pasajes principales:

  • Se elabora una sonda complementaria a la secuencia conocida y se marca con un marcador fluorescente, como por ejemplo fluoresceína, incorporando nucleótidos que tienen el marcador unido a ellos.
  • Los cromosomas se colocan en un portaobjetos de microscopio y se desnaturalizan
  • La sonda se desnaturaliza y se agrega al portaobjetos del microscopio, lo que permite que la sonda se hibride con su sitio complementario.
  • Se lava el exceso de sonda y se observan los cromosomas con un microscopio fluorescente. La sonda se mostrará como una o más señales fluorescentes en el microscopio, dependiendo de cuántos sitios puede hibridar.


FISH se usa ampliamente para varias aplicaciones de diagnóstico como, por ejemplo, identificación de anomalías numéricas y estructurales, caracterización de cromosomas marcadores, monitoreo de los efectos de la terapia, detección de enfermedad residual mínima. Además, tiene muchas aplicaciones en la investigación, como el mapeo de genes o la identificación de genes amplificados. FISH también se utiliza para comparar los genomas de dos especies biológicas para deducir relaciones evolutivas.

(Linda Petrucci): ARN Hibridación in situ fluorescente es un tipo específico de hibridación in situ dirigida al ARN en lugar de a las moléculas de ADN que utiliza sondas complementarias al ARN diana. Estas sondas se pueden detectar con microscopía de fluorescencia mediante detección directa o utilizando técnicas de amplificación inmunofluorescente.

La detección directa es posible mediante el uso de un conjunto de sondas, generalmente oligonucleótidos de ADN monocatenario, marcados con uno o más colorantes fluorescentes para tener suficiente visibilidad para sobrepasar la autofluorenscencia de fondo y, por lo tanto, ser detectados con un microscopio específico. El uso de un conjunto de sondas en lugar de una sola mejora la posibilidad de distinguir la propia sonda del ARN real, mucho más brillante, reduciendo el número de falsos positivos. Los falsos negativos son realmente poco probables porque las posibilidades de que todas las sondas no se unan son bastante bajas. La detección directa también brinda la posibilidad de utilizar diferentes colores para diferentes objetivos al mismo tiempo, con el fin de distinguirlos de los demás durante el análisis.

Las técnicas indirectas en realidad evitan todos los problemas debidos a la fluorescencia de fondo en la detección directa; de hecho, se encontraron muchos métodos para amplificar la señal de la sonda, incluida la inmunoquímica indirecta o la unión a las sondas que pueden ser reconocidas por anticuerpos conjugados con enzimas, p. Ej. reacción de biotina-estreptavidina. El único problema con este método es la gran cantidad de pasos que aumentan la posibilidad de error y el costo general de la técnica.

Los peces de ARN se utilizan principalmente para detectar la expresión génica, especialmente en biología del desarrollo. Una de las principales ventajas que ofrece el uso de la tecnología FISH es que nos permite seguir los movimientos del objetivo dentro de una célula viva, lo que permite al investigador estudiar, por ejemplo, la disposición de genes en el núcleo y destacar las principales diferencias entre Conjunto de diferentes líneas celulares de expresión de genes. Esta técnica permite la detección de ARN en caso de distribución celular simétrica y distribución subcelular asimétrica de ARN.

(Katie Znidericz): A lo largo de los años, la técnica FISH se ha adaptado y diversificado para lograr una herramienta de diagnóstico de rango más amplio con capacidades mejoradas, como la mejora en la sensibilidad, la especificidad y la resolución. Una de estas adaptaciones es Immuno-FISH.

Como su nombre indica, es una combinación de dos técnicas valiosas: inmunotinción y FISH, para que podamos analizar la muestra dada no solo desde el punto de vista del genotipo sino también del fenotipo, es decir. las proteínas que se expresan. Es fácil de realizar y no requiere más tiempo que la técnica FISH habitual. Este método nos permite visualizar territorios cromosómicos, subregiones cromosómicas, genes únicos y transcripciones de ARN preservando sus posiciones espaciales en el núcleo celular.

Immuno-FISH se puede utilizar tanto con el cromosoma aplanado 2D como con los núcleos conservados en 3D, y es con el FISH 3D que podemos analizar tanto el ADN como las proteínas en la misma muestra. Sin embargo, algunos pasos del procedimiento FISH pueden interferir con la inmunotinción. La "nueva generación" de microscopios confocales que permiten las distintas visualizaciones de al menos cinco fluorocromos diferentes dentro de un experimento abrió el camino para experimentos multicolores 3D-FISH. Y así, se pueden localizar simultáneamente muchos objetivos nucleares etiquetados de manera diferente.

Si bien FISH se puede combinar con la detección de proteínas celulares y nucleares, pueden surgir algunos problemas con la detección después del pretratamiento de permeabilización y la desnaturalización del ADN, ya que algunos antígenos pueden no ser lo suficientemente estables para resistirlos. Por eso es importante a la hora de planificar el experimento utilizar diferentes estrategias dependiendo de la proteína, por ejemplo, puede ser necesario utilizar anticuerpos primarios y secundarios.

Habitualmente los protocolos sugieren fijación, pretratamientos, hibridación antes de la técnica FISH. Sin embargo, una hibridación eficaz requiere una serie de pasos de permeabilización y la desnaturalización del ADN celular. Estos pasos deben equilibrarse cuidadosamente para mantener la mejor morfología nuclear posible, por un lado, y hacer que la cromatina sea accesible para la penetración de la sonda, por otro lado. Pequeñas desviaciones o errores experimentales pueden cambiar fácilmente la calidad del resultado experimental.

4. Pintura de cromosomas

(Laura Zanatto): La pintura de cromosomas se refiere a la hibridación de grupos de sondas compuestas específicas de cromosomas marcadas con fluorescencia con preparaciones citológicas. Con FISH, la pintura de cromosomas se puede utilizar para analizar todo el genoma, lo que permite detectar aberraciones cromosómicas. Antes de FISH, las pruebas de cribado citogenético para detectar aberraciones numéricas y estructurales se limitaban a los análisis de bandas cromosómicas convencionales. Sin embargo, la pintura de cromosomas también se ha convertido en una herramienta versátil en disciplinas de investigación básicas que van desde la biología de la radiación hasta la citogenética evolutiva y la investigación que trata sobre aspectos de la estructura nuclear.


Las sondas de pintura de cromosomas se han mejorado rápidamente y se han modificado en varios aspectos. La primera generación de sondas, basada en bibliotecas de fagos específicos de cromosomas, fue bastante engorrosa de usar, debido a las bajas proporciones de inserto a vector que con frecuencia dieron como resultado una tinción de fondo relativamente alta. Algunas de estas limitaciones se superaron con la disponibilidad de bibliotecas de plásmidos en las que una relación inserto-vector mejorada y una generación de sondas más fácil mejoraron considerablemente la calidad de la pintura. Se utilizaron dos enfoques alternativos para alcanzar el objetivo de cariotipar cromosomas en color:

1. Filtros ópticos específicos de fluorocromos, denominados m-FISH

2. Imágenes espectrales basadas en interferómetro (introducidas como cariotipado espectral o SKY).

(Rachele Rosso): La hibridación multiplex in situ (M-FISH) representa uno de los desarrollos más significativos en citogenética molecular de la última década, es una técnica de cariotipo de 24 colores y es el método de elección para estudiar arreglos de orejas intercromosómicas complejas. El proceso se compone de tres pasos principales:

  • El etiquetado multiplex de todos los cromosomas en el genoma con números finitos de fluoróforos espectralmente distintos, de modo que cada par homólogo de cromosomas está etiquetado de forma única.
  • La visualización microscópica y la adquisición digital de cada fluoróforo utilizando conjuntos de filtros de paso de banda únicos específicos y software M-FISH dedicado. A continuación, estas imágenes adquiridas se superponen, lo que permite clasificar los cromosomas individuales en función de la composición de flúor de acuerdo con el esquema de etiquetado combinatorio del cóctel de sondas M-FISH utilizado.
  • El análisis detallado de estas imágenes adquiridas y procesadas digitalmente para resolver anomalías estructurales y numéricas.

(Laura Zanatto): El cariotipo espectral (SKY) es una técnica FISH que se refiere a la citogenética molecular
análisis de preparaciones en metafase mediante microscopía espectral. Cribado de cariotipos celulares para cromosomas
anomalías es una parte integral del diagnóstico de cánceres humanos y
enfermedades congénitas y SKY permite pintar cada uno de los 24 cromosomas humanos
con diferentes colores. SKY se basa en una sola exposición a través de un
filtro óptico de paso de banda triple y análisis espectroscópico. La imagen espectral es
no depende de la intensidad de la fluorescencia, sino únicamente de las firmas espectrales
creado por etiquetado combinatorio.

Después de las preparaciones en metafase, las sondas se hibridan.
Las sondas de pintura específicas de cromosomas se obtienen mediante clasificación de flujo y se amplifican
por dos rondas de DOP-PCR. Luego está la desnaturalización de la muestra y
sondas y después de la hibridación. Después de la hibridación in situ y
inmunodetección, se adquiere una imagen espectral utilizando una fluorescencia convencional
microscopio de luz.

SKY será muy útil en citogenética clínica y
nos permiten identificar traslocación, eliminación o alteración en metafásicos
cromosomas, pero no es posible evaluar anomalías estructurales, como
como inversión, deleción, inserción y duplicación en el mismo cromosoma, porque
estos se muestran con el mismo color.

SKY será muy útil para el análisis citogenético de
tumores sólidos, porque los cariotipos de células cancerosas pueden ser muy complejos, con muchos
de aberraciones. Algunos conjuntos de sondas se basan en ensayos centroméricos repetitivos.
Sondas satélite, que se pueden utilizar para algunos diagnósticos. También hematológico
Las neoplasias malignas se pueden estudiar con FISH, como algunos casos de leucemia y
linfoma (Fig: leucemia AML). Los resultados del cromosoma
El análisis de la trisomía 11/22 usando SKY se muestra en la Fig: como podemos ver, SKY es
uno de los enfoques más eficaces en la actualidad para la identificación de un
cromosoma extra de origen desconocido. Esta técnica también se puede utilizar en
citogenético comparativo para definir cromosoma
reordenamientos que ocurrieron durante el curso de la evolución.



5. PESCADO: ventajas y
desventajas

(Simone Rocco): Esta técnica se basa en la
capacidad de una sonda de ADN, marcada con un fluoróforo, para unirse específicamente a un
secuencia complementaria de ADN diana. FISH se puede utilizar para cromosomas metafásicos,
núcleos en interfase, fibras de cromatina o micromatrices de ADN. Un punto interesante es
que el FISH realizó en células en interfase (PESCADO en interfase o iFISH) fue el método que produjo la mayor
resulta en diagnósticos onco-hematológicos. Las sondas utilizadas en FISH se pueden
diferente: todas las sondas de pintura de cromosomas nos permitieron identificar los cromosomas
involucrados en anomalías estructurales, mientras que las sondas de un solo locus fueron
fundamental no solo en el mapeo de genes, sino también en la detección de puntos de ruptura
en translocaciones cromosómicas.

La leucemia linfática crónica (CLL) es la
mejor ejemplo para comprender cuál fue la contribución de iFISH en el estudio de
poblaciones de células con un índice mitótico inferior al 1%. El análisis de cromosomas
de los pacientes que padecen CLL a menudo no proporciona resultados para la ausencia
de estados en metafase o demuestra un kit cromosómico normal en el 40-50% de
casos. En cambio, iFISH identifica anomalías del cariotipo en el 65% de
pacientes analizados durante el diagnóstico o durante una fase estable de la enfermedad
y en el 88% de los pacientes con enfermedad progresiva (?). Otro ejemplo es el agudo
Leucemia linfoblástica de células B (LLA): se definieron 106 alteraciones del cariotipo
gracias a FISH, mientras que solo 34 con técnicas de anillado.

Sin embargo, tenemos que considerar que este
La técnica tiene sus límites. De hecho, debemos saber de antemano qué tipo de cromosomas
anomalía que esperamos encontrar, para poder elegir la más adecuada
sonda para el análisis. Además, dado que un número limitado de fluorocromos
puede utilizarse, el FISH no puede analizar simultáneamente más de tres
anomalías. Sin embargo, también todos estos límites se han resuelto recientemente gracias a
la introducción de multiplex-FISH (M-FISH) y Cariotipo espectral (SKY), que se discutieron anteriormente. En cuanto al uso de la tecnología FISH
en todo el mundo, encontramos que la técnica FISH tiene un uso muy limitado en
países en desarrollo debido a la falta de disponibilidad y la falta de conocimientos especializados.


El conjunto completo de CellProfiler 38,60 pipelines utilizados y las imágenes de entrada de ejemplo para cada uno están disponibles en https://github.com/brianbeliveau/SABER. PD3D, un paquete de funciones de MATLAB para detectar puntos SABRE (u otros puntos fluorescentes) en 3D y asignar puntos a las células en una segmentación de cuencas hidrográficas, está disponible en https://github.com/ewest11/PD3D. Las funciones utilizadas para el procesamiento de imágenes están disponibles en http://saber.fish o http://saber-fish.net/.

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Citogenética en interfase de las células del esputo para la detección temprana de la carcinogénesis pulmonar

Esta perspectiva sobre Varella-García et al. (que comienza en la p. XX en este número de la revista) examina el papel de la fluorescencia de interfase en el lugar hibridación (FISH) para la detección precoz del cáncer de pulmón. Este trabajo que involucra FISH en interfase es un paso importante hacia la identificación y validación de un marcador molecular en muestras de esputo para la detección temprana del cáncer de pulmón y destaca el valor de establecer estudios de cohortes con biodepósitos de muestras recolectadas de participantes seguidas a lo largo del tiempo para el desarrollo de la enfermedad.

El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos entre hombres y mujeres [1]. Las muertes estimadas por cáncer de pulmón en 2009 excedieron las de los siguientes cuatro cánceres más mortales combinados (colorrectal, mama, próstata y páncreas ref. [2]). La tasa de supervivencia global a cinco años para el cáncer de pulmón es inferior al 15%, en gran parte debido a la etapa tardía en el momento del diagnóstico y la falta de terapias eficaces para la enfermedad avanzada [3]. Sin embargo, las tasas de supervivencia a cinco años para el cáncer de pulmón diagnosticado en su etapa más temprana se acercan al 70%, por lo que se necesitan con urgencia técnicas mejoradas para detectar el cáncer de pulmón temprano y ensayos apropiados que demuestren que la detección temprana puede reducir la mortalidad por cáncer de pulmón. Esta detección temprana se relaciona con la prevención del cáncer en términos de detección de cáncer microscópico en pacientes a los que se podría evitar que desarrollen consecuencias clínicas o de identificar a los individuos de muy alto riesgo (no cancerosos) que más necesitan enfoques quimiopreventivos.

La idea de que puede ser posible detectar el cáncer de pulmón examinando las células exfoliadas en el esputo no es nueva. Hace más de cuatro décadas, Saccomanno y sus colegas desarrollaron las técnicas estándar actuales para la recolección, procesamiento y evaluación de esputo [4], y para principios de la década de 1970 habían descrito los cambios citológicos que ocurren durante el desarrollo del cáncer de pulmón [5]. Sin embargo, los grandes estudios aleatorizados de citología del esputo y detección de rayos X de tórax en el pasado no pudieron demostrar que estos enfoques redujeran la mortalidad por cáncer de pulmón [6]. Los avances en la tecnología durante las décadas intermedias y una mejor comprensión de la base molecular y genética de la carcinogénesis pulmonar [7] son ​​prometedores para el desarrollo de pruebas de diagnóstico molecular en muestras de esputo que pueden mejorar la detección temprana y la precisión del diagnóstico. Un avance importante de este tipo es la detección de aberraciones cromosómicas por citogenética de interfase en células epiteliales de muestras de esputo [8].

La citogenética de interfase se refiere a la visualización de aberraciones cromosómicas en núcleos celulares intactos basados ​​en en el lugar hibridación con sondas de ácido nucleico marcadas. Cremer y sus colegas introdujeron el concepto de citogenética en interfase en 1986, cuando lograron utilizar una sonda de ADN específica del centrómero para marcar el número de copias del cromosoma 18 en núcleos de células normales y en núcleos de un paciente con síndrome de Edward que portaba una trisomía de este cromosoma. [9]. Poco después, los investigadores lograron la visualización de aberraciones cromosómicas estructurales mediante sondas de pintura de cromosomas completos [10] o sondas que se dirigen a reordenamientos cromosómicos específicos [11, 12]. Fluorescencia de interfase en el lugar La hibridación (FISH) utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para detectar alteraciones cromosómicas y puede combinarse con la evaluación simultánea del inmunofenotipo de las células [13]. Una ventaja de la interfase FISH es que se puede aplicar a muestras citológicas como el esputo, así como a tejido fijado en formalina e incluido en parafina, lo que permite el análisis de bioespecímenes almacenados y la correlación de los resultados con criterios de valoración clínicos. Otra ventaja crítica es que los resultados se generan a partir de células individuales en lugar de a partir de ADN extraído de una muestra combinada. La evaluación de los cambios en el número de copias en las células individuales es particularmente importante para analizar las lesiones tempranas, para las cuales las muestras combinadas pueden contener suficientes células & # x0201c & # x0201d contaminantes & # x0201d, incluidos los tejidos o linfocitos circundantes normales y el estroma conectivo, para diluir la población de, y así prevenir la detección de cambios en el número de copias en células anormales.

En este número de la revista, Varella-García y sus colegas informan sobre la predicción del cáncer de pulmón mediante la detección de cambios en el número de copias de genes mediante la sonda FISH LAVysion & # x02122 (Abbott Molecular) colocada en el esputo [14]. Este conjunto de sondas disponibles comercialmente se dirige a MI C oncogén (8q24), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) gen (7p12), una banda en el cromosoma 5 (5p15) y el centrómero del cromosoma 6 (CEP6). Estos investigadores evaluaron previamente la viabilidad de este conjunto de sondas para la detección de cáncer de pulmón, demostrando que se podían detectar anomalías cromosómicas en muestras de esputo y preparaciones de tacto tumoral de pacientes con cáncer, pero no en muestras de esputo citológicamente normales de pacientes sin cáncer [15]. El informe actual detalla un estudio de casos y controles de la asociación entre los cambios en el número de copias detectados por FISH y el cáncer de pulmón incidente. Este estudio se anidó en una cohorte prospectiva de individuos con antecedentes de tabaquismo intenso y obstrucción del flujo de aire. Cuando dos o más de estas sondas FISH mostraron números de copia anormales en muestras de esputo recolectadas dentro de los 18 meses anteriores al diagnóstico de cáncer, el ensayo FISH predijo el diagnóstico de cáncer de pulmón en general con una sensibilidad del 76% y una especificidad del 88%. (Esta cuestión de tiempo de 18 meses se analiza más adelante). Los casos de cáncer de pulmón tenían 29,9 veces más probabilidades (IC del 95%, 9,5-94,1) de tener un ensayo FISH de esputo anormal que los controles. Aunque las anomalías detectadas por el ensayo FISH se correlacionaron con el examen citológico convencional de las muestras de esputo, el rendimiento diagnóstico no mejoró significativamente al combinar el ensayo FISH con la citología frente al ensayo FISH solo, según lo evaluado por los análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC). Además, la sensibilidad para el carcinoma de células escamosas fue mucho mejor (94%) que para otras histologías (69%). Este hallazgo no es inesperado dado que la mayoría de los cánceres de células escamosas surgen en las vías respiratorias centrales.

El presente estudio destaca el valor de la cohorte del Programa Especializado de Excelencia en Investigación del Cáncer de Pulmón de la Universidad de Colorado (SPORE) que se estableció en 1993 para probar biomarcadores prometedores identificados en el laboratorio [16]. Los marcos conceptuales para la validación de biomarcadores que se han descrito enfatizan la importancia de establecer estudios de cohorte con repositorios de bioespecímenes recolectados y almacenados de participantes que son seguidos a lo largo del tiempo para el desarrollo de la enfermedad [17, 18]. La cohorte Colorado SPORE incluye aproximadamente 2500 fumadores adultos o ex fumadores con alto riesgo de cáncer de pulmón debido a un historial de tabaquismo intenso y la presencia de enfermedad pulmonar obstructiva crónica indicada por obstrucción del flujo de aire en la espirometría [19]. Limitar la inscripción en esta cohorte de tamaño modesto a estos adultos de alto riesgo ha asegurado el desarrollo de un número suficiente de casos de cáncer de pulmón durante un período de seguimiento relativamente corto. Las muestras biológicas relevantes que incluyen suero, ADN y esputo se recolectaron al inicio del estudio. Estudios anteriores han demostrado altas tasas de atipia moderada en muestras de esputo de esta cohorte y que la atipia moderada o peor era un predictor débil de cáncer de pulmón incidente [16, 20]. Más recientemente, Belinsky y sus colegas utilizaron este recurso para demostrar que la metilación aberrante del promotor de genes en muestras de esputo era predictiva de cáncer de pulmón [21]. En el presente estudio, Varella-García y sus colegas ampliaron su trabajo anterior [15, 22] para demostrar que el ensayo FISH aplicado a muestras de esputo era un predictor mucho más fuerte de cáncer de pulmón que la citología o la metilación del promotor de genes aberrantes en este estudio. grupo. Aunque este nuevo trabajo proporciona un paso significativo hacia la identificación y validación de un marcador molecular de detección temprana, hay puntos importantes que deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados y establecer direcciones de investigación futuras.

Es importante señalar que la inscripción en esta cohorte se limitó a individuos de alto riesgo con obstrucción significativa del flujo de aire, un grupo para el que es relativamente fácil obtener esputo expectorado espontáneo [23]. Las muestras de esputo espontáneo de individuos de alto riesgo sin obstrucción del flujo de aire pueden no tener suficiente celularidad para el análisis FISH. Incluso en el presente estudio, aproximadamente el 14% de las muestras se consideraron inadecuadas para el análisis FISH porque contenían menos de 100 células epiteliales nucleadas con buenas señales de hibridación. El esputo también se puede recolectar por inducción después de la inhalación de solución salina con un nebulizador, aunque este procedimiento debe realizarse en una clínica y, por lo tanto, es menos atractivo para el cribado de la población. Se ha demostrado que la combinación de la muestra para la tos de la primera mañana durante tres días es tan eficaz como el esputo inducido para diagnosticar el cáncer de pulmón en personas con obstrucción del flujo de aire [24]. Queda por determinar si los individuos de alto riesgo sin obstrucción del flujo de aire pueden producir un esputo espontáneo adecuado para el análisis FISH. Se necesitan estudios futuros para evaluar las características del ensayo FISH cuando se aplica a muestras de esputo recolectadas en cohortes de alto riesgo sin obstrucción del flujo de aire para garantizar que la metodología y los hallazgos sean reproducibles en estas poblaciones.

Otro punto importante a considerar es que el ensayo FISH fue más sensible para el carcinoma de células escamosas que para otros subtipos, lo que plantea la cuestión de si la prueba es lo suficientemente sensible para la detección de otros subtipos histológicos de cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón es una neoplasia compleja y heterogénea que probablemente tiene múltiples vías de desarrollo preneoplásicas [25]. La secuencia de cambios que ocurren en el epitelio bronquial que conducen al desarrollo del carcinoma de células escamosas está bien descrita, pero los eventos que conducen a otros tipos de cáncer de pulmón son menos claros. Además, los cambios genéticos específicos que se encuentran en los cánceres de pulmón de células pequeñas difieren de los que se encuentran en los cánceres de pulmón de células no pequeñas [26]. La literatura citogenética sugiere que podría ser posible mejorar la sensibilidad para otras histologías tumorales mediante la inclusión de sondas adicionales dirigidas a desequilibrios genómicos comunes. Por ejemplo, la inclusión de una sonda para el brazo largo del cromosoma 3 debería aumentar la sensibilidad, especialmente para los cánceres de pulmón de células pequeñas, mientras que los adenocarcinomas muestran con frecuencia aumentos en el número de copias de los cromosomas 1 y 20 [27, 28], incluidas las sondas para estos dos últimos. los cromosomas probablemente aumentarían la sensibilidad para detectar adenocarcinoma. También es posible apuntar a genes que se pierden en el cáncer de pulmón, aunque esto puede ser problemático ya que el número de señales reducido o inexistente puede ser el resultado de un fallo de hibridación. No obstante, estudios recientes han demostrado que las deleciones que se asignan a las bandas cromosómicas 3p22.1 y 10q22 pueden detectarse de forma fiable mediante FISH aplicado a cepillados bronquiales en epitelio no canceroso adyacente a tumores [29] y en muestras de esputo [30].

Es intrigante plantear la hipótesis de por qué el ensayo FISH utilizado en el estudio de Varella-García y sus colegas es más sensible dentro de los 18 meses previos al diagnóstico en lugar de más de 18. Como sugirieron los investigadores, este hallazgo probablemente refleja que este ensayo está detectando efectos de campo de células epiteliales tardías que predicen un riesgo muy alto de desarrollar cáncer de pulmón o que el cáncer de pulmón ya está presente y las células tumorales se están exfoliando. Los cánceres diagnosticados dentro de una ventana muy corta de la recolección de esputo inicial en este estudio pueden considerarse mejor casos de cáncer de pulmón prevalentes en lugar de casos incidentes.Este problema podría aclararse comparando el patrón de señal en las células del esputo con el de las células del tumor primario. Si el patrón de aneuploidía coincide estrechamente, es razonable suponer que efectivamente se detectaron células exfoliadas. Alternativamente, la inestabilidad cromosómica general en las muestras de esputo versus un patrón clonal en los cánceres primarios podría sugerir que el proceso de cancerización de campo resultó en ganancias y pérdidas cromosómicas aleatorias en el epitelio bronquial premaligno y que los clones con un patrón de cáncer de clung y # x0201clung eran seleccionados para la progresión al cáncer.

Los autores también señalan que el ensayo FISH que utilizaron requiere mucha mano de obra y no está listo para su aplicación clínica inmediata. Si bien esto es cierto, se están desarrollando, o ya están disponibles, varios sistemas automatizados de imágenes que logran ciertos niveles de automatización, tanto para la adquisición como para el análisis de imágenes (visitar http://www.riedlab.nci.nih.gov/links.asp para obtener una lista de sistemas). Las mediciones cuantitativas del contenido de ADN nuclear, que es rápido, sería un parámetro adicional a considerar para al menos preseleccionar las células con mayor probabilidad de contener aneuploidías cromosómicas. Aunque la aplicación de la interfase FISH a los tumores sólidos se ha retrasado con respecto a su uso en neoplasias hematológicas, su utilidad para detectar células tumorales en muestras citológicas parece ser cada vez más apreciada. Por ejemplo, un cóctel de sondas para la visualización de aneuploidías en muestras de orina ha mostrado un gran potencial para el diagnóstico de cáncer de vejiga recurrente [31]. Asimismo, la detección de ganancias del cromosoma 3q (es decir, amplificación genómica del gen de la telomerasa humana TERC) en la displasia cervical de bajo grado pueden discernir lesiones con un riesgo bajo o alto de progresión [32]. Por lo tanto, es justo concluir que la interfase FISH para la detección temprana de tumores sólidos aún no ha entrado en el mejor momento y que una vez que se demuestre completamente su utilidad, es probable que se resuelvan los problemas actuales de rendimiento en términos de adquisición y análisis de imágenes.

El último punto importante con respecto al estudio de interfase FISH que se abordará aquí es que los avances tecnológicos en los métodos de imágenes radiológicas, que se han producido en paralelo con los avances en biología molecular y genética, apuntan a un papel emergente de los biomarcadores no invasivos en el esputo y al potencial recursos para validar estos marcadores. Los primeros estudios no aleatorizados de imágenes por tomografía computarizada (TC) helicoidal arrojaron resultados prometedores, en particular para detectar cánceres que surgen en las vías respiratorias periféricas. La TC helicoidal, sin embargo, puede ser menos sensible para los tumores de localización central [33]. Además, puede ser difícil distinguir los nódulos benignos de los malignos, en particular los muy pequeños, y las pruebas de TC con falsos positivos pueden dar lugar a procedimientos invasivos innecesarios. La comunidad de cáncer de pulmón está actualmente a la espera de los resultados del Ensayo Nacional de Detección de Cáncer de Pulmón (NLST) lanzado en 2002 por el Instituto Nacional del Cáncer. Este ensayo aleatorizado y controlado compara el efecto de la TC helicoidal con el de la radiografía de tórax estándar sobre la mortalidad por cáncer de pulmón, el criterio de valoración de referencia para los estudios de detección, en aproximadamente 53.000 fumadores actuales o exfumadores en los EE. UU. El NLST ha medido la espirometría para evaluar el flujo de aire y las muestras biológicas recolectadas, incluido el esputo, la sangre y la orina de un subconjunto de participantes. El ensayo de cribado neerlandés-belga de cáncer de pulmón (también conocido como ensayo de Nederlands-Leuvens Longkanker Screenings Onderzoek [NELSON]) es otro gran ensayo de cribado por TC controlado y aleatorizado que producirá resultados informativos [34]. Incluso si los resultados de estos ensayos aleatorizados muestran una relación beneficio-riesgo favorable para la TC, es probable que el desarrollo de biomarcadores no invasivos siga desempeñando un papel en el perfeccionamiento de la población de alto riesgo para optimizar los beneficios y daños clínicos de la detección. mejorando la sensibilidad de la TC para las lesiones de localización central y ayudando en el tratamiento clínico de los nódulos detectados por TC de importancia clínica incierta.

Los biomarcadores como el ensayo FISH aplicado a muestras de esputo descrito por Varella-García et al. [14] podrían complementar la exploración por TC. Apoyando este concepto, un pequeño estudio transversal reciente de otro grupo que utilizó un conjunto diferente de sondas FISH mostró que las pruebas para HYAL2 (3p21.3), FHIT (3p14.2), p16 (9p21) y SPA (10q22) en muestras de esputo mediante FISH aumentó el diagnóstico de tumores centrales en estadio I en comparación con la TC sola [35]. Las técnicas de interfase FISH también pueden ayudar en el diagnóstico de nódulos detectados por TC en las vías respiratorias periféricas. Por ejemplo, un estudio reciente demostró la capacidad de la interfase FISH para distinguir nódulos benignos de malignos detectados por TC cuando se aplica a células obtenidas por aspiración con aguja fina, incluida la identificación de adenocarcinomas, que normalmente se presentan en localizaciones periféricas [36]. En conclusión, la detección de cambios en el número de copias cromosómicas mediante FISH tiene el potencial de mejorar la detección temprana del cáncer de pulmón, en particular como complemento de la tomografía computarizada. Una mayor evaluación y validación de este enfoque en otras cohortes ayudará a definir completamente el papel de la interfase FISH para la detección temprana del cáncer de pulmón.


Tres generaciones de regiones cromosómicas diseñadas

Para implementar nuestro objetivo de desarrollar un método de etiquetado cromosómico que preservara la estructura cromosómica nativa, desarrollamos un enfoque basado en el reconocimiento de proteína-ADN utilizando el sistema lac operador / represor lac (Robinett et al. 1996). Una única repetición directa del operador lac de 256 mer produjo una señal detectable en células de ovario de hámster chino (CHO) que expresan de forma estable el represor GFP-lac. Sin embargo, aunque una sola inserción es suficiente para localizar un locus génico, no revela la conformación de cromatina a gran escala de este locus. Como nuestro enfoque de primera generación, por lo tanto, usamos la amplificación de genes en células DHFR menos CHO DG44 usando un mini-gen de ADNc de DHFR etiquetado con la repetición del operador lac de 256 mer. Las células DG44 con inserciones estables del plásmido DHFR se sometieron a múltiples rondas de selección con metotrexato, produciendo regiones teñidas homogéneamente (HSR) de varios a

100 Mbp de tamaño que contienen múltiples copias de la inserción del plásmido flanqueadas por 100s & # x020131000s de kb de ADN genómico coamplificado.

Es importante destacar que estas regiones cromosómicas amplificadas por genes mostraron conformaciones de cromatina a gran escala características particulares de clones celulares específicos, debido a diferencias en las secuencias de ADN coamplificadas. Estas conformaciones variaron desde cuerpos heterocromáticos inusualmente condensados ​​(Fig. 3A) hasta estructuras más extendidas típicas de la eucromatina circundante (Fig. 3B) (Li et al. 1998 Dietzel y Belmont 2001 Verschure et al. 2005 Kireev et al. 2008). Una ventaja de este enfoque fue que la conformación de cromatina a gran escala característica de estas regiones cromosómicas amplificadas era estable para cada clon celular particular. Sin embargo, una desventaja importante fue que el tamaño y la ubicación cromosómica de estas regiones cromosómicas amplificadas generalmente eran inestables.

(A & # x02013B) La amplificación de genes produce regiones cromosómicas amplificadas tanto condensadas (A) como extendidas (B). (C) Las inserciones de plásmido de copias múltiples forman masas hetereocromáticas condensadas. (D) La inserción de copias múltiples de BAC que contienen loci génicos activos forman conformaciones de cromatina extendidas a gran escala típicas de la cromatina endógena circundante. DAPI (rojo), represor GFP-lac (verde). Barra de escala = 2 & # x003bcm.

Como método de segunda generación, por lo tanto, recurrimos a la selección de líneas celulares con inserciones de copias múltiples de un plásmido que lleva entre 32 & # x02013256 copias de la repetición directa del operador lac (Strukov et al. 2003 Dietzel et al. 2004). Las inserciones con cientos o miles de copias de plásmidos produjeron grandes regiones cromosómicas marcadas. La ventaja de este enfoque de segunda generación fue que la ubicación y el tamaño de las inserciones de plásmido fueron muy estables en el tiempo en cultivo. Sin embargo, la principal desventaja de este enfoque fue que estas inserciones de plásmidos de múltiples copias en células de mamíferos forman casi invariablemente estructuras heterocromáticas condensadas inusualmente (Fig. 3C). Las excepciones son los clones celulares en los que las copias del plásmido se recombinan con el ADN genómico, de modo que las inserciones están espaciadas por grandes regiones de ADN genómico.

Trabajos anteriores han demostrado el silenciamiento transgénico de inserciones de plásmidos de múltiples copias, lo que probablemente está relacionado con su conformación de heterocromatina observada. En contraste, los cromosomas artificiales bacterianos (BAC) que llevan insertos de ADN genómico de 100 & # x02013300 kb muestran típicamente niveles de expresión transgénica dentro de varias veces los niveles de expresión de genes endógenos. Presumimos que esta expresión génica mejorada se correlacionaría con una estructura de cromatina a gran escala más normal. Por lo tanto, para nuestro enfoque de tercera generación, estamos utilizando inserciones de copias múltiples de transgenes BAC adaptadas con la repetición del operador lac 256mer más un marcador seleccionable (Hu et al. 2009). Este enfoque BAC combina las ventajas de los dos enfoques anteriores: conformación de cromatina a gran escala específica de secuencia y comportamiento de espejo de posicionamiento nuclear de loci de genes endógenos combinados con estabilidad genómica de la repetición del transgén BAC. Para las regiones de genes activos, se observa una conformación de cromatina a gran escala similar a la eucromatina endógena circundante (Fig. 3C) (Kireev et al. 2008 Hu et al. 2009).


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5 CLASIFICACIÓN DE CROMOSOMAS PARA DIVERSAS APLICACIONES

Los cromosomas vegetales clasificados por citometría de flujo se han utilizado en una variedad de aplicaciones, incluida la citogenética molecular, la biología molecular, la secuenciación del genoma y la clonación de genes y la proteómica [36]. La forma en que se clasifican los cromosomas para cada aplicación puede diferir como se describe a continuación.

5.1 Preparación de ADN de alto peso molecular para la construcción de bibliotecas BAC, mapeo óptico y secuenciación de ADN de lectura larga

Para mantener la integridad del ADN cromosómico, los cromosomas deben aislarse en un tampón optimizado para este propósito [59]. Dado que estas aplicaciones requieren de cientos de nanogramos a varios microgramos de ADN, se debe clasificar una gran cantidad de cromosomas (típicamente de 10 5 a 10 6). Al determinar el número de cromosomas a clasificar, es necesario considerar el tamaño molecular del cromosoma clasificado, el hecho de que los cromosomas mitóticos tienen dos cromátidas y también las pérdidas durante la preparación de ADN de HMW a partir de cromosomas clasificados, que pueden alcanzar el 75%. –80%. En el trigo harinero, un rendimiento de clasificación típico es de 400 000 a 900 000 cromosomas por día de trabajo, por lo que la preparación de ADN de HMW lleva días o incluso semanas, y será necesario preparar muchas muestras de cromosomas. Los cromosomas se clasifican en tubos de poliestireno de baja unión de ADN de 1,5 ml en lotes, que van desde 200.000 a 700.000 para la construcción de bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y mapeo óptico, respectivamente. Se recomienda clasificar en tampón de aislamiento de cromosomas 1,5 × (220 μl para la construcción de la biblioteca BAC y 770 μl para el mapeo óptico) para contrarrestar la dilución por el fluido de la vaina.

5.2 Secuenciación de ADN cromosómico amplificado

Muchas aplicaciones en biología molecular y genómica no requieren ADN de alto peso molecular, y las muestras de ADN con tamaños de fragmentos de hasta 20 kb son suficientes. Esto ofrece la posibilidad de emplear la amplificación del genoma completo del ADN para producir cantidades de microgramos de ADN a partir de un número menor de cromosomas [97]. El número de cromosomas que deben clasificarse depende del tamaño del cromosoma, y ​​se determina de manera que se obtenga el equivalente a 40 ng de ADN clasificado. En el caso del trigo harinero, esto corresponde a alrededor de 20 a 30 mil cromosomas, dependiendo del tamaño de los cromosomas. Los cromosomas se clasifican en tubos de PCR de 0,5 ml que contienen 40 µl de agua desionizada estéril. Los tubos con cromosomas se centrifugan usando una microcentrífuga inmediatamente después de la clasificación y se mantienen a -20 ° C hasta que se utilizan para la amplificación del ADN.

5.3 Secuenciación de ADN cromosómico no amplificado

La introducción de protocolos para las bibliotecas de secuenciación de Illumina que requieren cantidades de nanogramos de ADN o menos, hizo posible omitir el paso de amplificación cromosómica. De hecho, la secuenciación del ADN cromosómico no amplificado da como resultado mejores ensamblajes en comparación con los del ADN amplificado [90]. El número de cromosomas clasificados y la forma en que se recolectan es el mismo que en el protocolo para secuenciar el ADN amplificado. Los tubos con cromosomas se centrifugan usando una microcentrífuga inmediatamente después de la clasificación y se mantienen a -20 ° C hasta que se usan para la preparación de bibliotecas de secuenciación de ADN.

5.4 Secuenciación de ADN cromosómico de copia única

Como en este caso se amplifican cantidades minúsculas de ADN, se deben tomar precauciones especiales para evitar la contaminación de la muestra por ADN de otros organismos y las muestras deben procesarse en condiciones estériles en una campana de flujo laminar. Los cromosomas individuales se clasifican en 3 µl de mezcla de amplificación del genoma completo en tubos de PCR de 0,2 ml, que se esterilizan en autoclave [96]. Para preparar un control positivo, se clasifican 1000 cromosomas en otro tubo. Un control negativo es el tubo de PCR de 0,2 ml con la mezcla de amplificación y sin cromosomas. Todos los tubos con cromosomas deben centrifugarse con una microcentrífuga inmediatamente después de la clasificación.

5.5 Captura de conformación cromosómica (Hi-C)

La clasificación por flujo de cromosomas se puede utilizar para estudiar la conformación de la cromatina mediante la inferencia de sus contactos espaciales en forma de todos contra todos utilizando un método de captura de la conformación cromosómica denominado Hi-C [98]. Como la fijación de formaldehído es un paso crucial en este análisis e impacta directamente en los resultados de la secuenciación, debe optimizarse y, por lo general, difiere ligeramente de los protocolos estándar utilizados para preparar suspensiones de cromosomas intactos. Para obtener un número suficiente de contactos entre los loci de ADN, se clasifican de 3 a 5 millones de cromosomas por réplica en tubos de 15 ml de proteína de baja unión con 2 ml de tampón LB01, que se mantienen en hielo durante todo el procedimiento de clasificación.

5.6 Análisis proteómico

El análisis proteómico requiere que las proteínas de los cromosomas clasificados por flujo estén protegidas de la degradación. Esto se logra mediante el uso de un tampón de aislamiento de cromosomas modificado y un tampón modificado en el que se clasifican los cromosomas. Para mejorar la accesibilidad de las proteínas cromosómicas, también se recomienda reducir el grado de fijación de formaldehído de las puntas de las raíces sincronizadas. Esta aplicación ha sido desarrollada para estudiar la composición proteica de los cromosomas mitóticos en metafase [60] y se clasifican todos los cromosomas de una planta, evitando la necesidad de discriminar un tipo de cromosoma particular. Por tanto, la frecuencia de muestreo puede ser mayor, alcanzando los 6000 cromosomas / s, y los rendimientos de clasificación oscilan entre 3,5 y 6,6 millones de cromosomas / día laborable. Para aislar suficientes proteínas para la espectrometría de masas, se requieren de 5 a 10 millones de cromosomas clasificados. Para acomodar la gran cantidad de gotitas con cromosomas clasificados, la clasificación se realiza en tubos de poliestireno de 5 ml, que contienen 1 ml de tampón de aislamiento de cromosomas modificado.


Cromosomas humanos

En el nivel submicroscópico, los cromosomas consisten en un complejo extremadamente elaborado, formado por superenrollamientos de ADN, que se ha comparado con la red de cables estrechamente enrollada que se ve en un solenoide (p. 31). Bajo el microscopio electrónico, se puede ver que los cromosomas tienen una morfología redondeada y bastante irregular (Figura 3.1). Sin embargo, la mayor parte de nuestro conocimiento de la estructura cromosómica se ha obtenido mediante microscopía óptica. Las tinciones especiales captadas selectivamente por el ADN han permitido identificar cada cromosoma individual. Estos se ven mejor durante la división celular, cuando los cromosomas se contraen al máximo y los genes constituyentes ya no se pueden transcribir.

(Cortesía de la Dra. Christine Harrison. Reproducido de Harrison et al 1983 Cytogenet Cell Genet 35: 21–27 con permiso del editor, S. Karger, Basel.)

En este momento, se puede ver que cada cromosoma consta de dos hebras idénticas conocidas como cromátidas, o cromátidas hermanas, que son el resultado de la replicación del ADN que tuvo lugar durante la fase S (síntesis) del ciclo celular (pág. 39). Se puede ver que estas cromátidas hermanas están unidas en una constricción primaria conocida como centrómero. Los centrómeros constan de varios cientos de kilobases de ADN repetitivo y son responsables del movimiento de los cromosomas en la división celular. Cada centrómero divide el cromosoma en brazos cortos y largos, designados p (= pequeño) yq ("g" = grande), respectivamente.


Citogenética en interfase de las células del esputo para la detección temprana de la carcinogénesis pulmonar

Esta perspectiva sobre Varella-García et al. (a partir de la p. 447 en este número de la revista) examina el papel de la fluorescencia de interfase en el lugar hibridación para la detección precoz del cáncer de pulmón. Este trabajo es un paso importante hacia la identificación y validación de un marcador molecular en muestras de esputo para la detección temprana del cáncer de pulmón y destaca el valor de establecer estudios de cohorte con biodepósitos de muestras recolectadas de los participantes seguidos a lo largo del tiempo para el desarrollo de la enfermedad. Cancer Prev Res 3 (4) 416–9. © 2010 AACR.

Perspectiva sobre Varella-García et al., P. 447

Lea la perspectiva relacionada de Gomperts et al., P. 420

El cáncer de pulmón es la principal causa de muerte por cáncer en los Estados Unidos entre hombres y mujeres (1). Las muertes estimadas por cáncer de pulmón en 2009 excedieron las de los siguientes cuatro cánceres más mortales combinados (colorrectal, mama, próstata y páncreas ref. 2). La tasa de supervivencia general a 5 años para el cáncer de pulmón es inferior al 15%, en gran parte debido a la etapa tardía en el momento del diagnóstico y la falta de terapias efectivas para la enfermedad avanzada (3). Sin embargo, las tasas de supervivencia a 5 años para el cáncer de pulmón diagnosticado en su etapa más temprana se acercan al 70%, por lo que se necesitan con urgencia técnicas mejoradas para detectar el cáncer de pulmón de manera temprana y ensayos apropiados que demuestren que la detección temprana puede reducir la mortalidad por cáncer de pulmón. Esta detección temprana se relaciona con la prevención del cáncer en términos de detección de cáncer microscópico en pacientes a los que se podría evitar que desarrollen consecuencias clínicas o de identificar a los individuos de muy alto riesgo (no cancerosos) que más necesitan enfoques quimiopreventivos.

La idea de que puede ser posible detectar el cáncer de pulmón examinando las células exfoliadas en el esputo no es nueva. Hace más de cuatro décadas, Saccomanno y sus colegas desarrollaron las técnicas estándar actuales para la recolección, procesamiento y evaluación de esputo (4) y, a principios de la década de 1970, describieron los cambios citológicos que ocurren durante el desarrollo del cáncer de pulmón (5). Sin embargo, los grandes estudios aleatorizados de citología de esputo y detección de rayos X de tórax en el pasado no pudieron demostrar que estos enfoques redujeran la mortalidad por cáncer de pulmón (6). Los avances en la tecnología durante las décadas intermedias y una mejor comprensión de la base molecular y genética de la carcinogénesis pulmonar (7) son prometedores para el desarrollo de pruebas de diagnóstico molecular en muestras de esputo que pueden mejorar la detección temprana y la precisión del diagnóstico. Un avance importante de este tipo es la detección de aberraciones cromosómicas por citogenética de interfase en células epiteliales de muestras de esputo (8).

La citogenética de interfase se refiere a la visualización de aberraciones cromosómicas en núcleos celulares intactos basados ​​en en el lugar hibridación con sondas de ácido nucleico marcadas. Cremer y sus colegas introdujeron el concepto de citogenética en interfase en 1986, cuando lograron utilizar una sonda de ADN específica del centrómero para marcar el número de copias del cromosoma 18 en núcleos de células normales y en núcleos de un paciente con síndrome de Edward que portaba una trisomía de este cromosoma. (9). Poco después, los investigadores lograron la visualización de aberraciones cromosómicas estructurales mediante sondas de pintura de cromosomas completos (10) o sondas que se dirigen a reordenamientos cromosómicos específicos (11, 12). Fluorescencia de interfase en el lugar La hibridación (FISH) utiliza sondas de ADN marcadas con fluorescencia para detectar alteraciones cromosómicas y se puede combinar con la evaluación simultánea del inmunofenotipo de las células (13). Una ventaja de la interfase FISH es que se puede aplicar a muestras citológicas como el esputo, así como a tejido fijado con formalina e incluido en parafina, lo que permite el análisis de bioespecímenes almacenados y la correlación de los resultados con criterios de valoración clínicos. Otra ventaja crítica es que los resultados se generan a partir de células individuales en lugar de a partir de ADN extraído de una muestra combinada. La evaluación de los cambios en el número de copias en las células individuales es particularmente importante para analizar las lesiones tempranas, para las cuales las muestras agrupadas pueden contener suficientes células "contaminantes", incluido el tejido o linfocitos circundantes normales y el estroma conectivo, para diluir la población de, y así prevenir la detección de cambios en el número de copias en células anormales.

En este número de la revista, Varella-García y sus colegas informan sobre la predicción del cáncer de pulmón mediante la detección de cambios en el número de copias de genes a través de la sonda LAVysion (Abbott Molecular) FISH colocada en el esputo (14). Este conjunto de sondas disponibles comercialmente se dirige a MI C oncogén (8q24), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) gen (7p12), una banda en el cromosoma 5 (5p15) y el centrómero del cromosoma 6 (CEP6). Estos investigadores evaluaron previamente la viabilidad de este conjunto de sondas para la detección de cáncer de pulmón, demostrando que se podían detectar anomalías cromosómicas en muestras de esputo y preparaciones de tacto tumoral de pacientes con cáncer, pero no en muestras de esputo citológicamente normales de pacientes sin cáncer (15). El informe actual detalla un estudio de casos y controles de la asociación entre los cambios en el número de copias detectados por FISH y el cáncer de pulmón incidente. Este estudio se anidó en una cohorte prospectiva de individuos con antecedentes de tabaquismo intenso y obstrucción del flujo de aire. Cuando dos o más de estas sondas FISH mostraron números de copias anormales en las muestras de esputo recolectadas dentro de los 18 meses anteriores al diagnóstico de cáncer, el ensayo FISH predijo el diagnóstico de cáncer de pulmón en general con una sensibilidad del 76% y una especificidad del 88%. (Esta cuestión de tiempo de 18 meses se analiza más adelante). Los casos de cáncer de pulmón tenían 29,9 veces más probabilidades (IC del 95%, 9,5-94,1) de tener un ensayo FISH de esputo anormal que los controles. Aunque las anomalías detectadas por el ensayo FISH se correlacionaron con el examen citológico convencional de las muestras de esputo, el rendimiento diagnóstico no mejoró significativamente al combinar el ensayo FISH con la citología frente al ensayo FISH solo, según lo evaluado por los análisis de la curva de características operativas del receptor. Además, la sensibilidad para el carcinoma de células escamosas fue mucho mejor (94%) que para otras histologías (69%). Este hallazgo no es inesperado dado que la mayoría de los cánceres de células escamosas surgen en las vías respiratorias centrales.

El estudio actual destaca el valor de la cohorte del Programa de Excelencia en Investigación Especializada en Cáncer de Pulmón de la Universidad de Colorado que se estableció en 1993 para probar biomarcadores prometedores identificados en el laboratorio (16). Los marcos conceptuales para la validación de biomarcadores que se han descrito enfatizan la importancia de establecer estudios de cohortes con repositorios de bioespecímenes recolectados y almacenados de participantes que son seguidos a lo largo del tiempo para el desarrollo de la enfermedad (17, 18). La cohorte del Programa Especializado de Excelencia en Investigación de Colorado incluye aproximadamente 2,500 fumadores adultos o ex fumadores con alto riesgo de cáncer de pulmón debido a un historial de tabaquismo intenso y la presencia de enfermedad pulmonar obstructiva crónica indicada por la obstrucción del flujo de aire en la espirometría (19). Limitar la inscripción en esta cohorte de tamaño modesto a estos adultos de alto riesgo ha asegurado el desarrollo de un número suficiente de casos de cáncer de pulmón durante un período de seguimiento relativamente corto. Las muestras biológicas relevantes que incluyen suero, ADN y esputo se recolectaron al inicio del estudio. Estudios anteriores han mostrado altas tasas de atipia moderada en muestras de esputo de esta cohorte y que la atipia moderada o peor era un predictor débil de cáncer de pulmón incidente (16, 20). Más recientemente, Belinsky y sus colegas utilizaron este recurso para demostrar que la metilación del promotor de genes aberrantes en muestras de esputo era predictiva de cáncer de pulmón (21). En el presente estudio, Varella-García y sus colegas ampliaron su trabajo anterior (15, 22) para demostrar que el ensayo FISH aplicado a muestras de esputo era un predictor mucho más fuerte de cáncer de pulmón que la citología o la metilación del promotor de genes aberrantes en este estudio. grupo. Aunque este nuevo trabajo proporciona un paso significativo hacia la identificación y validación de un marcador molecular de detección temprana, hay puntos importantes que deben tenerse en cuenta al interpretar los resultados y establecer direcciones de investigación futuras.

Es importante señalar que la inscripción en esta cohorte se limitó a individuos de alto riesgo con obstrucción significativa del flujo de aire, un grupo para el cual es relativamente fácil obtener esputo expectorado espontáneo (23). Las muestras de esputo espontáneo de individuos de alto riesgo sin obstrucción del flujo de aire pueden no tener suficiente celularidad para el análisis FISH. Incluso en el presente estudio, aproximadamente el 14% de las muestras se consideraron inadecuadas para el análisis FISH porque contenían menos de 100 células epiteliales nucleadas con buenas señales de hibridación. El esputo también se puede recolectar por inducción después de la inhalación de solución salina con un nebulizador, aunque este procedimiento debe realizarse en una clínica y, por lo tanto, es menos atractivo para el cribado de la población. Se ha demostrado que la combinación de la muestra de tos de la primera mañana durante 3 días es tan eficaz como el esputo inducido para diagnosticar el cáncer de pulmón en personas con obstrucción del flujo de aire (24). Queda por determinar si los individuos de alto riesgo sin obstrucción del flujo de aire pueden producir un esputo espontáneo adecuado para el análisis FISH. Se necesitan estudios futuros para evaluar las características del ensayo FISH cuando se aplica a muestras de esputo recolectadas en cohortes de alto riesgo sin obstrucción del flujo de aire para garantizar que los métodos y hallazgos sean reproducibles en estas poblaciones.

Otro punto importante a considerar es que el ensayo FISH fue más sensible para el carcinoma de células escamosas que para otros subtipos, lo que plantea la cuestión de si la prueba es lo suficientemente sensible para la detección de otros subtipos histológicos de cáncer de pulmón. El cáncer de pulmón es una neoplasia compleja y heterogénea que probablemente tiene múltiples vías de desarrollo preneoplásicas (25). La secuencia de cambios que ocurren en el epitelio bronquial que conducen al desarrollo del carcinoma de células escamosas está bien descrita, pero los eventos que conducen a otros tipos de cáncer de pulmón son menos claros. Además, los cambios genéticos específicos que se encuentran en los cánceres de pulmón de células pequeñas difieren de los que se encuentran en los cánceres de pulmón de células no pequeñas (26). La literatura citogenética sugiere que podría ser posible mejorar la sensibilidad para otras histologías tumorales mediante la inclusión de sondas adicionales dirigidas a desequilibrios genómicos comunes. Por ejemplo, la inclusión de una sonda para el brazo largo del cromosoma 3 debería aumentar la sensibilidad, especialmente para los cánceres de pulmón de células pequeñas, mientras que los adenocarcinomas muestran con frecuencia aumentos en el número de copias de los cromosomas 1 y 20 (27, 28), incluidas las sondas para estos dos últimos. los cromosomas probablemente aumentarían la sensibilidad para detectar adenocarcinoma.También es posible apuntar a genes que se pierden en el cáncer de pulmón, aunque esto puede ser problemático porque el número de señales reducido o inexistente puede ser el resultado de un fallo de hibridación. Sin embargo, estudios recientes han demostrado que las deleciones que se asignan a las bandas cromosómicas 3p22.1 y 10q22 pueden detectarse de manera confiable mediante FISH aplicado a cepillados bronquiales en epitelio no canceroso adyacente a tumores (29) y en muestras de esputo (30).

Es intrigante plantear la hipótesis de por qué el ensayo FISH utilizado en el estudio de Varella-García y sus colegas es más sensible dentro de los 18 meses antes del diagnóstico en lugar de más. Como sugirieron los investigadores, este hallazgo probablemente refleja que este ensayo está detectando efectos de campo de células epiteliales tardías que predicen un riesgo muy alto de desarrollar cáncer de pulmón o que el cáncer de pulmón ya está presente y las células tumorales se están exfoliando. Los cánceres diagnosticados dentro de una ventana muy corta de la recolección de esputo inicial en este estudio pueden considerarse casos de cáncer de pulmón prevalentes en lugar de casos incidentes. Este problema podría aclararse comparando el patrón de señal en las células del esputo con el de las células del tumor primario. Si el patrón de aneuploidía coincide estrechamente, es razonable suponer que efectivamente se detectaron células exfoliadas. Alternativamente, la inestabilidad cromosómica general en las muestras de esputo versus un patrón clonal en los cánceres primarios podría sugerir que el proceso de cancerización de campo resultó en ganancias y pérdidas cromosómicas aleatorias en el epitelio bronquial premaligno y que los clones con un "patrón de cáncer de pulmón" fueron seleccionados para progresión al cáncer.

Los autores también señalan que el ensayo FISH que utilizaron requiere mucha mano de obra y no está listo para su aplicación clínica inmediata. Si bien esto es cierto, se están desarrollando, o ya están disponibles, varios sistemas automatizados de imágenes que logran ciertos niveles de automatización para la adquisición y el análisis de imágenes (visite http://www.riedlab.nci.nih.gov/links.asp para obtener una listado de sistemas). Las mediciones cuantitativas del contenido de ADN nuclear, que es rápido, sería un parámetro adicional a considerar para al menos preseleccionar las células con mayor probabilidad de contener aneuploidías cromosómicas. Aunque la aplicación de la interfase FISH a los tumores sólidos se ha retrasado con respecto a su utilización en neoplasias hematológicas malignas, su utilidad para detectar células tumorales en muestras citológicas parece ser cada vez más apreciada. Por ejemplo, un cóctel de sondas para la visualización de aneuploidías en muestras de orina ha mostrado un gran potencial para el diagnóstico de cáncer de vejiga recurrente (31). Asimismo, la detección de ganancias del cromosoma 3q (es decir, amplificación genómica del gen de la telomerasa humana TERC) en displasia cervical de bajo grado pueden discernir lesiones con bajo o alto riesgo de progresión (32). Por lo tanto, es justo concluir que la interfase FISH para la detección temprana de tumores sólidos aún no ha entrado en el mejor momento y que una vez que se demuestre completamente su utilidad, es probable que se resuelvan los problemas de rendimiento actuales en términos de adquisición y análisis de imágenes.

El último punto importante con respecto al estudio de interfase FISH que se abordará aquí es que los avances tecnológicos en los métodos de imágenes radiológicas, que se han producido en paralelo con los avances en biología molecular y genética, apuntan a un papel emergente de los biomarcadores no invasivos en el esputo y al potencial recursos para validar estos marcadores. Los primeros estudios no aleatorizados de imágenes por tomografía computarizada (TC) helicoidal arrojaron resultados prometedores, en particular para detectar cánceres que surgen en las vías respiratorias periféricas. La TC helicoidal, sin embargo, puede ser menos sensible para los tumores de localización central (33). Además, puede ser difícil distinguir los nódulos benignos de los malignos, en particular los muy pequeños, y las pruebas de TC con falsos positivos pueden dar lugar a procedimientos invasivos innecesarios. La comunidad del cáncer de pulmón está actualmente a la espera de los resultados del Ensayo Nacional de Detección de Cáncer de Pulmón lanzado en 2002 por el Instituto Nacional del Cáncer. Este ensayo controlado aleatorio compara el efecto de la TC helicoidal con el de la radiografía de tórax estándar sobre la mortalidad por cáncer de pulmón, el criterio de valoración de referencia para los estudios de detección, en aproximadamente 53.000 fumadores actuales o exfumadores en los Estados Unidos. El Ensayo Nacional de Detección de Cáncer de Pulmón ha medido la espirometría para evaluar el flujo de aire y muestras biológicas recolectadas que incluyen esputo, sangre y orina de un subconjunto de participantes. El ensayo de cribado de cáncer de pulmón holandés-belga [también conocido como ensayo de Nederlands-Leuvens Longkanker Screenings Onderzoek (NELSON)] es otro gran ensayo de cribado por TC controlado y aleatorizado que producirá resultados informativos (34). Incluso si los resultados de estos ensayos aleatorizados muestran una relación beneficio-riesgo favorable para la TC, es probable que el desarrollo de biomarcadores no invasivos siga desempeñando un papel en el perfeccionamiento de la población de alto riesgo para optimizar los beneficios y daños clínicos del cribado. mejorando la sensibilidad de la TC para las lesiones de localización central y ayudando en el tratamiento clínico de los nódulos detectados por TC de importancia clínica incierta.

Los biomarcadores como el ensayo FISH aplicado a muestras de esputo descrito por Varella-García y colegas (14) podrían complementar la exploración por TC. Apoyando este concepto, un pequeño estudio transversal reciente de otro grupo que utilizó un conjunto diferente de sondas FISH mostró que las pruebas para HYAL2 (3p21.3), FHIT (3p14.2), p16 (9p21) y SPA (10q22) en muestras de esputo mediante FISH aumentó el diagnóstico de tumores centrales en estadio I en comparación con la TC sola (35). Las técnicas de interfase FISH también pueden ayudar en el diagnóstico de nódulos detectados por TC en las vías respiratorias periféricas. Por ejemplo, un estudio reciente mostró la capacidad de la interfase FISH para distinguir los nódulos benignos de los malignos detectados por CT cuando se aplica a las células obtenidas por aspiración con aguja fina, incluida la identificación de adenocarcinomas, que típicamente se presentan en localizaciones periféricas (36). En conclusión, la detección de cambios en el número de copias cromosómicas mediante FISH tiene el potencial de mejorar la detección temprana del cáncer de pulmón, particularmente como complemento de la tomografía computarizada. Una mayor evaluación y validación de este enfoque en otras cohortes ayudará a definir completamente el papel de la interfase FISH para la detección temprana del cáncer de pulmón.


Evolución de las técnicas genéticas: pasado, presente y más allá

La genética es el estudio de la herencia, lo que significa el estudio de genes y factores relacionados con todos los aspectos de los genes. La historia científica de la genética comenzó con los trabajos de Gregor Mendel a mediados del siglo XIX. Antes de Mendel, la genética era principalmente teórica, mientras que, después de Mendel, la ciencia de la genética se amplió para incluir la genética experimental. Los desarrollos en todos los campos de la genética y la tecnología genética en la primera mitad del siglo XX proporcionaron una base para los desarrollos posteriores. En la segunda mitad del siglo XX, el trasfondo molecular de la genética se ha vuelto más comprensible. Los rápidos avances tecnológicos, seguidos de la finalización del Proyecto Genoma Humano, han contribuido mucho al conocimiento de los factores genéticos y su impacto en la vida y las enfermedades humanas. Actualmente, se han identificado más de 1800 genes de enfermedades, se han disponible más de 2000 pruebas genéticas y, junto con esto, se han lanzado al mercado al menos 350 productos basados ​​en biotecnología. Las tecnologías novedosas, en particular la secuenciación de la próxima generación, han acelerado drásticamente el ritmo de la investigación biológica y, al mismo tiempo, han aumentado las expectativas. En este artículo, se ofrece un breve resumen de la historia genética con breves explicaciones de las técnicas genéticas más populares.

1. Introducción

Debido a los rápidos avances en las tecnologías genómicas, los análisis genéticos se han vuelto esenciales en la práctica clínica y la investigación. Durante la última década, se ha dado un gran paso para desentrañar los mecanismos subyacentes de los trastornos relacionados con la genética. Los hitos en la historia genética se resumen en la Figura 1. Además, los métodos de pruebas genéticas se han vuelto ampliamente accesibles y factibles de realizar incluso para laboratorios de pequeño tamaño, en particular después de la finalización del Proyecto Genoma Humano, que coincidió con los avances en la tecnología informática. Con la aplicación de las pruebas genéticas para la medicina personalizada, estamos en el comienzo de una era que brindará nuevos horizontes en la salud humana.

2. Historia de las técnicas genéticas y propiedades de los métodos

2.1. Técnicas citogenéticas convencionales

Mirando brevemente la historia, la genética es el término introducido para el estudio de genes en organismos. Muchos de los primeros descubrimientos contribuyeron como hitos importantes para hacer evolucionar el estudio de los genomas tal como se aplica en la actualidad. Uno de los pasos cruciales que permitió visualizar las estructuras intracelulares fue la invención del microscopio óptico de lente única por Janssen en 1595 [1]. Después de que muchos investigadores comenzaran a hacer observaciones con el microscopio recién inventado, Hooke propuso la descripción de la "célula" en 1665 [2]. Un botánico suizo Nageli describió por primera vez estructuras filiformes en los núcleos de las células vegetales en la década de 1840, lo que llamó "citoblastos transitorios", que posteriormente Waldeyer definiría como cromosomas en 1888 [3]. Después de que Charles Darwin publicó Sobre el origen de las especies mediante la selección natural en 1859, Gregor Mendel introdujo las leyes fundamentales de la herencia en 1865. Esto fue crucial para comprender que "algunas características de los organismos se heredan a través de los genes". Las reglas de Mendel fueron mejoradas por los experimentos de Thomas Hunt Morgan en 1910, quien descubrió que los genes eran responsables de la aparición de un fenotipo específico ubicado en los cromosomas. En 1911, se logró el primer mapa genético mapeando los genes de la mosca de la fruta. Desde el siglo XIX hasta mediados del siglo XX, no se entendía que la estructura del material genético hereditario era responsable de la herencia de los rasgos de una generación a la siguiente. En 1953, Watson y Crick describieron el modelo bicatenario, helicoidal, complementario y antiparalelo del ADN [4]. Compartieron el Premio Nobel de Medicina por este importante descubrimiento de la estructura del ADN en 1962. En 1966, el código genético del ADN se descubrió finalmente al definir que un codón que es una secuencia de 3 nucleótidos adyacentes codifica los aminoácidos. El descubrimiento del ADN y los cromosomas allanó el camino para la rápida mejora de la genética y el establecimiento de nuevas tecnologías que han tenido lugar durante los últimos 50 años.

El primer análisis genético se realizó en el campo de la citogenética. Aunque se publicó que el número de cromosomas humanos normales era 48, Tjio y Levan informaron en 1956 que el número correcto era 46 [5]. Después del establecimiento de la incorporación del método de cultivo de leucocitos periféricos con los métodos de fijación y tinción, fue posible identificar anomalías cromosómicas humanas asociadas con defectos congénitos específicos [6]. Solo unos años más tarde, cuando Tjio y Levan informaron el número correcto de cromosomas humanos, se encontraron varios informes que identificaban anomalías cromosómicas numéricas como la trisomía 21 en el síndrome de Down, la monosomía X y XXY en dos trastornos cromosómicos sexuales frecuentes, los síndromes de Turner y Klinefelter, respectivamente. publicado en 1959 [7-9]. Después de 1966, las técnicas genéticas se realizaron no solo en las muestras postnatales sino también en las muestras prenatales, ya que se demostró que las células fetales derivadas del líquido amniótico podían obtenerse mediante un procedimiento invasivo que se denomina amniocentesis. Steele y Breg informaron que las células cultivadas de líquido amniótico podrían usarse para determinar las aberraciones cromosómicas en el feto [10]. Sin embargo, la resolución de los cromosomas no fue lo suficientemente alta para determinar las aberraciones estructurales en las células cultivadas, lo que fue mejorado por las técnicas de bandas de alta resolución utilizando cultivos de linfocitos sincronizados establecidos por Yunis en 1976 [11]. Esta novedosa técnica de bandas permitió identificar la etiología genética de síndromes clínicamente bien conocidos como los síndromes Cri-du-Chat y Wolf-Hirschhorn. Además de las aberraciones desequilibradas en los pacientes, las anomalías cromosómicas subyacentes en aquellos casos que tienen translocaciones equilibradas con antecedentes de abortos espontáneos recurrentes o que tienen un hijo fallecido con múltiples anomalías congénitas, también se han descrito mediante el uso de técnicas de bandas de alta resolución. La relación entre los cromosomas y el cáncer también fue establecida por Boveri en 1902. Según la teoría de la mutación somática de Boveri, el cáncer es causado por al menos una mutación en las células que causa un defecto en el control de la proliferación y división celular [12]. Hizo hincapié en que la principal razón subyacente eran los cambios cromosómicos anormales en una célula cancerosa.

2.2. Técnicas citogenéticas moleculares

A pesar del establecimiento de técnicas de alta resolución que permitieron revelar muchos síndromes genéticos conocidos o desconocidos, varios casos con aberraciones submicroscópicas que no eran visibles a una resolución entre 500 y 1000 bandas permanecieron sin diagnosticar. En 1982 se desarrolló una nueva técnica denominada hibridación fluorescente in situ (FISH) en el campo de la citogenética molecular [13]. En este método, se unieron la citogenética y la genética molecular. FISH identifica secuencias específicas de ácidos nucleicos de núcleos en interfase o aplicadas en cromosomas en metafase de [14, 15]. Si bien esta técnica ha avanzado significativamente en la actualidad, anteriormente se basaba en el ARN ribosómico marcado radiactivamente hibridado con cromosomas acrocéntricos, seguido de la visualización de la hibridación mediante autorradiografía. En el pasado también se utilizaron varias técnicas anteriores a las técnicas basadas en la fluorescencia, como los sistemas de sondas basados ​​en enzimas y en oro [16]. La primera aplicación de FISH se estableció en 1980, cuando el ARN marcado directamente con fluoróforo se utilizó como sonda para secuencias específicas de ADN [17]. Langer y col. desarrolló una nueva técnica que implica el uso de una sonda no radiactiva para el etiquetado indirecto a través de la traducción de la mella [18]. En épocas posteriores, mediante el desarrollo de nuevas moléculas fluorescentes, que condujeron a una sonda marcada con fluorescencia directa e indirecta, la unión a bases de ADN mejoró los protocolos de FISH. Los reordenamientos cromosómicos podrían detectarse más fácilmente con una mayor resolución de la FISH en los núcleos de las metafases e interfases que podrían usarse tanto para el diagnóstico clínico como para la investigación. FISH también proporcionó la opción para el uso simultáneo de una o más sondas de ADN mediante el etiquetado de diferentes colores o combinaciones de colores. Se pueden utilizar varios tipos de sondas para FISH. Sondas de pintura de cromosomas completos, sondas de pintura de brazos de cromosomas y sondas centroméricas, subteloméricas y específicas de locus son algunos de los ejemplos que están disponibles para la detección de anomalías cromosómicas constitucionales y adquiridas específicas. En consecuencia, se estableció un gran número de enfoques sofisticados basados ​​en los métodos FISH, por ejemplo, SKY (cariotipado espectral FISH) [19], Q-FISH (cuantitativo FISH) [20], fibra-FISH [21], heterocromatina- M-FISH [22] (M-FISH multicolor FISH) [23], COBRA-FISH (etiquetado de relación binaria combinada FISH) [24], cenM-FISH (M-FISH específico del centrómero) [25] y otros FISH modificados enfoques. Los enfoques basados ​​en FISH más avanzados para el análisis de cromosomas completos son COBRA-FISH, M-FISH y SKY FISH. La hibridación de los 24 cromosomas humanos diferentes con sondas de pintura de cromosomas completos marcadas con una combinación de 5 fluoróforos diferentes permite visualizar cada cromosoma con un color específico. FISH también permitió mostrar que los cromosomas están compartimentados en territorios discretos en el núcleo [26]. Se describió una correlación entre la ubicación y el tamaño y el contenido genético de los cromosomas. Los cromosomas más pequeños y ricos en genes generalmente están situados hacia el interior, mientras que los cromosomas más grandes y pobres en genes generalmente están situados hacia la periferia del núcleo [27, 28]. Con el mapa exacto del genoma humano obtenido por el Proyecto Genoma Humano, cada vez más sondas de segmentos clonados y mapeados (cósmidos, PAC, BAC y YAC) están disponibles para fines de diagnóstico [29]. A la luz de estos estudios, se han comercializado varias pruebas FISH de diagnóstico clínico. La más notable es la prueba de deleción o duplicación de las regiones subteloméricas que conduce a un cuadro clínico caracterizado principalmente por múltiples anomalías congénitas y discapacidad intelectual. Las aberraciones subteloméricas se encuentran en aproximadamente el 5% de los pacientes [30-32] y este hallazgo sugiere que las aberraciones submicroscópicas (es decir, deleciones y duplicaciones) pueden estar presentes en todo el genoma, particularmente en pacientes que muestran fenotipos similares con investigaciones citogenéticas normales.

La evaluación de los reordenamientos cromosómicos en todo el genoma mediante FISH, que requiere mucho tiempo y es costosa, condujo al desarrollo de nuevas técnicas, como la hibridación genómica comparativa basada en matrices [33-35]. Kallioniemi et al. en 1992 para detectar desequilibrios genómicos en células tumorales [36]. Si miramos la evolución de las tecnologías genéticas, la aparición de nuevas tecnologías siempre ha sido inevitable debido a las necesidades reveladas por las tecnologías anteriores. Aunque los métodos basados ​​en la hibridación, que permiten el cribado de ARN, ADN o proteínas como Northern blot, Southern Blot o Western Blot, respectivamente, se utilizan ampliamente, en la década de 1990 se desarrollaron métodos de hibridación de microarrays innovadores y potentes. En lugar de hibridar una sonda marcada con el ADN objetivo en un portaobjetos, con array-CGH, ​​el ADN del paciente se hibrida con una gran cantidad de sondas bien caracterizadas inmovilizadas en un portaobjetos. Para resumir brevemente, en este método, el ADN del paciente se etiqueta con un color específico (verde) y se mezcla con exactamente la misma cantidad de ADN de un control normal, que se etiqueta con un color diferente (rojo). A continuación, esta mezcla de ADN se hibrida con el ADN de la sonda desnaturalizado en el vidrio y se miden las relaciones de intensidad de señal de la prueba con respecto a la referencia. El colorante amarillo aparece cuando tanto el ADN del paciente como el de referencia son iguales en proporción debido a la presencia de la misma cantidad de colorantes rojo y verde, mientras que las regiones con pérdidas en el número de copias se visualizan en rojo y las ganancias en verde. Esta técnica permite la detección de la variación del número de copias del genoma completo (CNV) (duplicaciones y deleciones) a alta resolución [36].

Array-CGH no pudo detectar los genes recesivos de la enfermedad, la aneuploidía en mosaico, la disomía uniparental (UPD) o los reordenamientos heterocromáticos. Debido a esta desventaja, se cree que se puede combinar con matrices SNP para mejorar la resolución de array-CGH [37]. Estos arreglos tienen la resolución más alta de todas las plataformas basadas en arreglos disponibles. Tienen una resolución de 10 a 15 veces mayor en comparación con el análisis FISH (5 a 10 kb) [38]. La combinación de genotipado de array-CGH y SNP en una única plataforma aumenta la capacidad de diagnóstico clínico y descubre la detección de variantes de números de copia pequeños [39]. Además, el CGH basado en matrices tiene la ventaja sobre FISH en el hecho de que no se necesitan células vivas para obtener cromosomas en metafase porque solo se necesita ADN para el análisis. El principal inconveniente de la CGH basada en matrices es que solo puede detectar reordenamientos desequilibrados y es incapaz de detectar aberraciones equilibradas como translocaciones, inversiones e inserciones cromosómicas. Sin embargo, recientemente, se desarrolló un protocolo de matriz modificado, llamado CGH de translocación (tCGH), para abordar los puntos críticos de translocación recurrentes [40].

2.3. Genética molecular

Los cambios genómicos más grandes, como deleciones, duplicaciones y translocaciones, pueden detectarse mediante métodos convencionales de cariotipado, FISH o matriz-CGH, ​​pero estas técnicas no pueden detectar cambios de un solo nucleótido. Las técnicas de genética molecular se desarrollaron rápidamente después del establecimiento de reacciones en cadena de la polimerasa que permitieron generar de miles a millones de copias de una secuencia de ADN particular [41].Mullis y Smith han compartido el Premio Nobel de Química de 1993 por su descubrimiento de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Aunque la PCR se desarrolló hace solo unas décadas, ha encontrado numerosas aplicaciones básicas y clínicas y es indispensable en la ciencia actual.

La ADN polimerasa Taq, que fue seleccionada como la primera “Molécula del año” por el Journal of Science, fue una gran ventaja en la tecnología de PCR [42]. La automatización de la PCR se facilitó en gran medida y se simplificó la detección de mutaciones genómicas. La PCR se utilizó previamente mediante las siguientes técnicas, como el polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), el polimorfismo de confirmación de una sola hebra (SSCP) y los métodos basados ​​en secuenciación. SSCP y RFLP, las técnicas más utilizadas para el método de detección de mutaciones en los laboratorios de diagnóstico genético, no pudieron detectar todas las mutaciones, por lo que se necesitaba el desarrollo de nuevos métodos. Si no se conoce la secuencia del gen de interés, puede resultar difícil interpretar los resultados de estas técnicas. La determinación de la secuenciación del ADN permitió identificar los cambios de nucleótidos definidos en los genes diana. Esta necesidad fue superada por Maxam y Gilbert al introducir la tecnología de secuenciación química Maxam-Gilbert basada en la modificación química del ADN seguida de la escisión en bases específicas [43]. A pesar de la eficacia del método de secuenciación de Maxam-Gilbert, el uso de sustancias químicas peligrosas y la incapacidad para leer fragmentos de PCR largos hicieron que este método fuera reemplazado por la secuenciación de Sanger que se basaba en la terminación de la cadena de didesoxinucleótidos [44]. El método de secuenciación manual de Sanger se ha mejorado mediante la introducción de la primera generación de secuenciadores de ADN automatizados [45]. La automatización de la secuenciación del ADN permitió secuenciar el genoma humano de una manera rápida y precisa.

Con los avances en el campo de la genética molecular, fue posible lanzar el Proyecto Genoma Humano para revelar el genoma humano completo. El programa se lanzó en los EE. UU. Con un esfuerzo del Departamento de Energía y los Institutos Nacionales de Salud en colaboración con 20 grupos en 1990. El primer borrador del genoma humano fue publicado en 2001 por el Consorcio Internacional de Secuenciación del Genoma Humano [46]. Este primer informe que cubre el 94% del genoma humano anunció que el genoma humano tenía entre 30.000 y 40.000 genes codificadores de proteínas y más de 1,4 millones de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP). Un día después, en paralelo con HGP, Craig Venter, que lanzó un proyecto de secuenciación del genoma humano de Celera Genomics utilizando el método de secuenciación con pistola, publicó la secuencia completa del genoma humano en Science [47]. Se declaró que el proyecto estaba terminado dos años y medio antes de la fecha prevista en 2003, coincidiendo con el 50 aniversario del artículo en el que Watson y Crick informaron sobre la doble hélice del ADN [48]. Se informó que había entre 20 000 y 25 000 genes presentes en el genoma humano que cubrían el 93% de la región eucromática. El Proyecto Genoma Humano no solo reveló la secuencia completa del genoma humano, sino que también condujo a una gran mejora en la tecnología de secuenciación. La amplificación del gen de interés en el (los) individuo (s) afectado (s) permitió revelar mutaciones asociadas con trastornos monogénicos específicos. Aunque la automatización del método tradicional de Sanger de secuenciación de ADN didesoxi aumenta la eficiencia de la secuenciación de ADN, todavía no era rentable ni rentable. Lynx Therapeutics desarrolló una nueva tecnología llamada secuenciación masivamente paralela (MPS) que elimina estas desventajas [49]. Esta tecnología que utiliza lecturas de múltiples reacciones simultáneamente y genera grandes cantidades de datos de secuencia en paralelo proporcionó un gran impulso para la secuenciación del exoma, la secuenciación del genoma completo y el perfil de transcriptoma y metilación. Esta tecnología de alto rendimiento que se llama tecnología de secuenciación de próxima generación (NGS) redujo el costo de secuenciación de un genoma humano a menos de $ 1.000. Se proyecta que esta tecnología secuenciará un genoma humano en 1 hora por $ 100 después de nuevas mejoras tecnológicas en un futuro próximo. La tecnología NGS se usa ampliamente para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación, como la detección de variantes genómicas raras mediante resecuenciación del genoma completo o secuenciación dirigida, perfiles de transcriptomas de células, tejidos y organismos, e identificación de marcadores epigenéticos para el diagnóstico de enfermedades. Una de las aplicaciones más exitosas de la tecnología NGS es el descubrimiento de variantes causales en todo el genoma en trastornos de un solo gen y paisajes genómicos complejos de muchas enfermedades. Si bien la secuenciación del genoma completo o del exoma completo es la estrategia más completa en el diagnóstico de enfermedades desconocidas y la identificación de nuevos genes de enfermedades, la secuenciación dirigida utilizando paneles de genes seleccionados puede reducir el tiempo y el costo de secuenciación al combinar las enfermedades en el mismo grupo o vía de genes. en cuadros clínicos conocidos como discapacidad intelectual, trastornos neurometabólicos o neoplasias [50].

Además de las ventajas rentables, la secuenciación de la pequeña parte del genoma permite reducir el número de variaciones que, a su vez, reducen el coste y el tiempo necesarios para la interpretación de los datos [51]. La secuenciación dirigida abrió una nueva ventana en el diagnóstico de varias enfermedades de etiología desconocida. Por ejemplo, es posible analizar más de 4800 genes que se identificaron en la base de datos de mutaciones de genes humanos (HGMD Professional) y el catálogo de herencia mendeliana en línea en el hombre (OMIM) en una sola ejecución para pacientes con trastornos genéticos desconocidos. Tras los rápidos avances en las tecnologías NGS, el papel de NGS en la práctica clínica habitual aumentará exponencialmente. El diagnóstico prenatal no invasivo mediante NGS es otra aplicación de esta nueva tecnología. El paso más importante en los procedimientos de diagnóstico prenatal es la obtención de material fetal para evaluar la condición genética. Durante años, se han utilizado pruebas invasivas y no invasivas para evaluar la salud fetal, en particular las anomalías cromosómicas, durante el embarazo. Las pruebas no invasivas miden los epifenómenos, que no analizan la patología subyacente al cuadro clínico de interés. Su sensibilidad y especificidad tampoco han alcanzado el nivel esperado a pesar de varios estudios. Por otro lado, se ha encontrado que las pruebas invasivas están asociadas con riesgos significativos tanto para la madre como para el feto. La identificación de ADN fetal libre de células en la circulación materna y el análisis de este material fetal mediante NGS abrió un nuevo horizonte en el campo de la atención médica reproductiva. A pesar de las principales ventajas de la tecnología NGS, los investigadores y médicos todavía tienen muchas preocupaciones sobre la implementación de NGS en la práctica [52]. La interpretación de una gran cantidad de datos obtenidos por la tecnología NGS, los problemas de facturación y seguros, la duración y el contenido del proceso de consentimiento, y la divulgación de hallazgos incidentales y variantes de importancia desconocida fueron los principales desafíos relacionados con la oferta de esta tecnología [53].

Hace aproximadamente 10 años, el cariotipo era el estándar de oro en pacientes con discapacidad intelectual, pero el análisis array-CGH se ha convertido en la prueba de diagnóstico de primera línea que reemplaza al cariotipo y al FISH en la actualidad. Como es evidente en este ejemplo, los enfoques de las enfermedades relacionadas con la genética podrían cambiar en paralelo con los avances en la tecnología y la ciencia. El “cromosoma Filadelfia” es uno de los ejemplos evolutivos más antiguos de la medicina personalizada al revelar paso a paso el factor etiológico y las opciones de tratamiento de una enfermedad utilizando el análisis genético a medida que se establecieron las mejoras en las técnicas genéticas. En 1960, se identificó un pequeño cromosoma llamado cromosoma Filadelfia como la causa de la leucemia mieloide crónica (LMC). En 1973 se demostró mediante la técnica de bandas cromosómicas que este cromosoma era el resultado de una translocación entre los cromosomas 9 y 22 [54, 55]. Se necesitaron más de 10 años para identificar el gen de fusión. BCR / ABL (región de clúster de punto de ruptura y homólogo del oncogén viral de leucemia murina de Abelson v-abl) a través de las mejoras de las técnicas moleculares [56]. Los siguientes estudios revelaron que este gen de fusión dio lugar a la activación de una tirosina quinasa, lo que condujo al descubrimiento de un fármaco inhibidor de la tirosina quinasa Gleevec que demostró ser un tratamiento de gran éxito para la LMC [57].

La prueba genética que se utilizará en el diagnóstico debe elegirse con mucho cuidado, ya que puede que no sea la más nueva o la más sofisticada. A veces, solo un cariotipo podría ser suficiente para identificar la condición genética en el paciente en lugar de métodos más complicados de matriz-CGH o NGS. A medida que la tecnología en genética evoluciona rápidamente, se deben considerar nuevos conocimientos en términos de interpretación de datos y asesoramiento genético, incluido el asesoramiento previo a la prueba, la devolución de resultados y el asesoramiento posterior a la prueba. Las bases de datos y los informes de consorcios sobre las experiencias de los médicos y genetistas son cruciales para la integración de la genómica en la práctica clínica.

3. Conclusión

Si los desarrollos en la genética y las tecnologías informáticas continúan avanzando a su velocidad actual, la historia nos ha demostrado que podemos esperar algunos desarrollos asombrosos en la vida humana en un futuro muy cercano. Algunos escenarios realistas de la vida humana en el futuro podrían incluso vernos llevando tarjetas de identidad, que incluyen las características de nuestro genoma, en lugar del formato que estamos usando actualmente. Las correcciones genéticas, los individuos y órganos clonados e incluso las técnicas de base genética como análisis de laboratorio primario en casi todas las enfermedades humanas para un médico ya no serán un sueño. Hoy en día, hemos llegado al punto en que las pruebas genéticas están disponibles comercialmente, el individuo ahora tiene los medios posibles para acceder a esta información delicada denominada prueba genética directa al consumidor (DTC). Al contrario de las pruebas tradicionales realizadas en hospitales o médicos, el acceso a la información genética de un individuo sin una interpretación médica o especializada ha ido encontrando un lugar en nuestra vida diaria. En la actualidad, más de 25 empresas, de todo el mundo, ofrecen servicio DTC al público. Sin embargo, se han planteado serias preocupaciones con respecto al uso de este tipo de servicio en términos de resultados engañosos e incidentales derivados de datos no comprobados o invalidados. Además, también existe un riesgo significativo de uso no autorizado de información genética sensible por parte de las grandes empresas, particularmente en campos como los seguros de salud. Por otro lado, el DTC proporciona un conocimiento temprano de las enfermedades genéticas y, por lo tanto, ofrece a las personas la oportunidad de desempeñar un papel activo en su propia atención médica. El tema en juego aquí nos lleva al mismo difícil dilema de ética médica: la autonomía del paciente y el derecho a conocer la composición genética de uno versus la no maleficencia.

Para concluir, en paralelo con los rápidos avances en el campo de las tecnologías genéticas, es necesario abordar cuestiones éticas y legales relacionadas con la implementación de esas tecnologías. Debido a que el uso de información genética personal parece tener un impacto directo en nuestra vida diaria en un futuro cercano, los protocolos deben discutirse en detalle, con pautas proporcionadas y actualizadas regularmente como parte de un enfoque multidisciplinario regulado.

Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses con respecto a la publicación de este artículo.

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