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¿Cuál es el destino del ADN de los micronúcleos?

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Los micronúcleos son estructuras celulares que se forman como un subproducto de, generalmente, mitosis defectuosa. El fragmento de cromosoma en un micronúcleo puede contener o no un centrómero y el ADN está envuelto en una membrana lipídica doble.

He tratado de encontrar información, pero no pude averiguar cuál es el destino de estas estructuras dentro de la célula una vez formada. ¿Y el ADN que contiene se ha perdido para la célula?


Emergencia de micronúcleos y sus efectos sobre el destino de las células bajo estrés por replicación (2010) explora cómo se comportan los micronúcleos y determinan el destino de las células. Descubrió que los micronúcleos están bastante relacionados con la apoptosis. Si las células con micronúcleos no pasaran por la apoptosis, hubo casos en los que los micronúcleos, literalmente, simplemente desaparecerían. No pudieron determinar si fue expulsado por la célula o reabsorbido en el núcleo principal. Sin embargo, también hubo casos en los que habría un aumento en el número de micronúcleos.

Llegaron a la conclusión de que hay varias formas en que la célula puede deshacerse de los micronúcleos y no pudieron determinar cuál es la más probable.

No pude encontrar ningún estudio en profundidad más reciente (que pudiera entender).


Entonces, de acuerdo con este documento, hay varias respuestas ...

  • Caso 1: Se reabsorbe en el núcleo y lo más probable es que se guarde la información que contiene.
  • Caso 2: Se expulsa de la celda y se pierde la información que contiene.
  • Caso 3: La célula sufre apoptosis y se pierde toda la información.

El destino de las células micronucleadas después de la irradiación X detectado por imágenes de células vivas

Los micronúcleos están estrechamente relacionados con el daño del ADN. La presencia de micronúcleos en células de mamíferos es un fenómeno común posterior a la radiación ionizante. El nivel de micronucleación en las células tumorales se ha utilizado para predecir el pronóstico después de la radioterapia en muchos cánceres. Para comprender cómo los micronúcleos inducidos por la irradiación afectan el destino celular, realizamos imágenes de células vivas extensas a largo plazo en células de carcinoma nasofaríngeo (NPC) irradiadas con X. Para visualizar la dinámica de los micronúcleos con mayor claridad, los cromosomas se marcaron de manera estable con proteína roja fluorescente (RFP) dirigiéndose a la histona humana H2B. Inicialmente, se observaron significativamente más micronúcleos en células radiosensibles que en células radiorresistentes después de la irradiación. Además, se encontró que las células con micronúcleos eran más propensas a morir o sufrir una detención del ciclo celular en comparación con las células sin micronúcleos después de la irradiación, y cuantos más micronúcleos contenían las células, más probable era que murieran o fueran detenidas. Además, las células micronucleadas mostraron predisposición a producir células hijas con micronúcleos a través del retraso cromosómico. La hibridación fluorescente in situ utilizando sondas pancentroméricas humanas reveló que aproximadamente el 70% de estos micronúcleos y cromosomas rezagados no contenían señales centroméricas. Finalmente, el daño del ADN fue más severo y la actividad de la quinasa de estrés p38 fue mayor en las células micronucleadas que en las células libres de micronúcleos, como se muestra por la tinción por inmunofluorescencia con fosfo-H2AX y fosfo-p38. En conjunto, nuestras observaciones indicaron que la presencia de micronúcleos junto con la respuesta al daño del ADN activado podría comprometer la capacidad de proliferación de las células irradiadas, proporcionando la evidencia y la justificación para usar el índice de micronúcleos como un valioso biomarcador de radiosensibilidad.


El destino de las células micronucleadas después de la irradiación X detectado por imágenes de células vivas

Los micronúcleos están estrechamente relacionados con el daño del ADN. La presencia de micronúcleos en células de mamíferos es un fenómeno común posterior a la radiación ionizante. El nivel de micronucleación en las células tumorales se ha utilizado para predecir el pronóstico después de la radioterapia en muchos cánceres. Para comprender cómo los micronúcleos inducidos por la irradiación afectan el destino celular, realizamos imágenes de células vivas extensas a largo plazo en células de carcinoma nasofaríngeo (NPC) irradiadas con X. Para visualizar la dinámica de los micronúcleos con mayor claridad, los cromosomas se marcaron de manera estable con proteína roja fluorescente (RFP) dirigiéndose a la histona humana H2B. Inicialmente, se observaron significativamente más micronúcleos en células radiosensibles que en células radiorresistentes después de la irradiación. Además, se encontró que las células con micronúcleos eran más propensas a morir o sufrir una detención del ciclo celular en comparación con las células sin micronúcleos después de la irradiación, y cuantos más micronúcleos contenían las células, más probable era que murieran o fueran detenidas. Además, las células micronucleadas mostraron predisposición a producir células hijas con micronúcleos a través del retraso cromosómico. Fluorescencia en el lugar La hibridación usando sondas pancentroméricas humanas reveló que aproximadamente el 70% de estos micronúcleos y cromosomas rezagados no contenían señales centroméricas. Finalmente, el daño del ADN fue más severo y la actividad de la quinasa de estrés p38 fue mayor en las células micronucleadas que en las células libres de micronúcleos, como se muestra por la tinción por inmunofluorescencia con fosfo-H2AX y fosfo-p38. En conjunto, nuestras observaciones indicaron que la presencia de micronúcleos junto con la respuesta al daño del ADN activado podría comprometer la capacidad de proliferación de las células irradiadas, proporcionando la evidencia y la justificación para usar el índice de micronúcleos como un valioso biomarcador de radiosensibilidad.


El destino de las células micronucleadas después de la irradiación X detectado por imágenes de células vivas

Los micronúcleos están estrechamente relacionados con el daño del ADN. La presencia de micronúcleos en células de mamíferos es un fenómeno común posterior a la radiación ionizante. El nivel de micronucleación en las células tumorales se ha utilizado para predecir el pronóstico después de la radioterapia en muchos cánceres. Para comprender cómo los micronúcleos inducidos por la irradiación afectan el destino de las células, realizamos imágenes de células vivas extensas a largo plazo en células de carcinoma nasofaríngeo (NPC) irradiadas con X. Para visualizar la dinámica de los micronúcleos con mayor claridad, los cromosomas se marcaron de manera estable con proteína roja fluorescente (RFP) dirigiéndose a la histona humana H2B. Inicialmente, se observaron significativamente más micronúcleos en células radiosensibles que en células radiorresistentes después de la irradiación. Además, se encontró que las células con micronúcleos tenían más probabilidades de morir o sufrir una detención del ciclo celular en comparación con las células sin micronúcleos después de la irradiación, y cuantos más micronúcleos contenían las células, más probabilidades tenían de morir o sufrir una detención. Además, las células micronucleadas mostraron predisposición a producir células hijas con micronúcleos a través del retraso cromosómico. La hibridación fluorescente in situ utilizando sondas pancentroméricas humanas reveló que aproximadamente el 70% de estos micronúcleos y cromosomas rezagados no contenían señales centroméricas. Finalmente, el daño del ADN fue más severo y la actividad de la quinasa de estrés p38 fue mayor en las células micronucleadas que en las células libres de micronúcleos, como se muestra por la tinción por inmunofluorescencia con fosfo-H2AX y fosfo-p38. En conjunto, nuestras observaciones indicaron que la presencia de micronúcleos junto con la respuesta al daño del ADN activado podría comprometer la capacidad de proliferación de las células irradiadas, proporcionando la evidencia y la justificación para usar el índice de micronúcleos como un valioso biomarcador de radiosensibilidad.


Organización genómica y destino del desarrollo de secuencias repetidas adyacentes en un clon de ADN plegable de Tetrahymena thermophila

La eliminación y el reordenamiento de la secuencia de ADN ocurre durante el desarrollo de linajes de células somáticas de eucariotas y se descubrió por primera vez hace más de un siglo. Sin embargo, no se comprenden la importancia y el mecanismo de eliminación de la cromatina. La eliminación del ADN también ocurre durante el desarrollo del macronúcleo somático del micronúcleo germinal en protozoos unicelulares ciliados como Tetrahymena thermophila. En este estudio, se usó ADN de repliegue del micronúcleo como sonda para aislar diez clones. Todos los analizados (4/4) contenían secuencias repetitivas en el micronúcleo y reorganizadas en el macronúcleo. La presencia de secuencias repetidas invertidas se demostró claramente en uno de ellos mediante microscopía electrónica. El análisis de la secuencia de ADN mostró que la parte izquierda de este clon contiene tres copias en tándem, directamente repetidas, de una secuencia de 340 pb, una parte de la cual aparece en orientación invertida a una distancia de 1,6 kb. Este clon, pTtFB1, se sometió a un análisis detallado de su destino en el desarrollo. Se subclonaron subregiones y se usaron como sondas contra transferencias Southern de ADN micronuclear y macronuclear. Encontramos que todas las subregiones definieron familias de secuencias repetidas en el genoma micronuclear. Se definió un mínimo de cuatro familias diferentes, dos de las cuales quedan retenidas en el macronúcleo y dos de las cuales se eliminan por completo. La familia de repetición invertida se conserva con poca reordenación. Dos de las familias, definidas por subregiones que no contienen partes de la repetición invertida, una en el "bucle" y otra en la "región flanqueante derecha", se eliminan totalmente durante el desarrollo macronuclear & # x02014 y contienen marcos de lectura abiertos. Una cuarta familia se encuentra en la región del "bucle" y se reordena ampliamente durante el desarrollo. Las dos familias de genes que se eliminan son estables en el genoma micronuclear pero no se agrupan como lo demuestran los experimentos en los que se utilizan ADN de cepas nulisómicas para mapear miembros de la familia en cromosomas micronucleares específicos. La familia de repeticiones invertidas también es estable en el genoma micronuclear y está dispersa entre varios cromosomas. Se discute la importancia de las repeticiones invertidas retenidas para el proceso de eliminación.


¿Cuál es la diferencia entre micronúcleos y macronúcleos?

Los ciliados tienen dos núcleos como micronúcleo y macronúcleo. El micronúcleo es el núcleo más pequeño y el núcleo reproductor. Por el contrario, el macronúcleo es el más grande y el núcleo no reproductivo. Entonces, esta es la diferencia clave entre micronúcleo y macronúcleo. El genoma del micronúcleo es diploide, mientras que el genoma del macronúcleo es poliploidía. Además, el micronúcleo contiene una pequeña cantidad de ADN, mientras que el macronúcleo contiene una gran cantidad de ADN. Por lo tanto, esta también es una diferencia entre micronúcleos y macronúcleos ...

La siguiente infografía resume la diferencia entre micronúcleo y macronúcleo.


4. Diferentes tipos de ensayos de micronúcleos

Aunque todos los tipos de MN se basan en el análisis de la frecuencia de los micronúcleos, varían en términos de células y protocolos utilizados. El resumen se da en la Tabla 3, seguido de una descripción más detallada.

Tabla 3

Tipos de ensayos de micronúcleos.

genotoxicidad in vitro o in vivo

experimentos biológicos donde se evalúa el daño citogenético.

genotoxicidad in vivo de productos químicos, fármacos o afecciones nocivas

Impacto de los hábitos de estilo de vida nutricional, como fumar y beber alcohol.

riesgo de envejecimiento acelerado, ciertos tipos de cáncer y enfermedades neurodegenerativas.

pronóstico de ciertos cánceres.

4.1. Ensayo de micronúcleos de bloqueo de citocinesis (CBMN)

La versión más popular de MN es el ensayo de micronúcleos de bloqueo de citocinesis (CBMN) [6,30] (Figura 1). Dado que el Mn es visible sólo después de la división celular, la citocalasina B que inhibe la polimerización de los filamentos de actina y la formación de microfilamentos contráctiles se utiliza para detener la citocinesis [42,43]. Sin embargo, la citocalasina B no detiene la cariocinesis, por lo que se forman células binucleadas con Mn presente en su citoplasma. La influencia de la citocalasina B sobre la proliferación celular y la inducción de Mn se discutió en el pasado [6,44]. La conclusión alcanzada indica que en la mayoría de los casos, el uso de citocalasina B no induce Mn adicional, por lo que se recomienda el uso de citocalasina B [5,6,30,45,46,47,48]. Esto es de especial importancia cuando se utilizan linfocitos humanos, ya que su ciclo celular puede variar entre individuos [4]. De acuerdo con el modelo matemático descrito por Fenech, el MN con citocalasina B aplicada para bloquear la citocinesis es superior al MN sin citocalasina B porque hay menos resultados negativos falsos cuando se usa MN con bloqueo de citocinesis [49].

Un principio del ensayo de micronúcleos de bloqueo de citocinesis. 1. Núcleo con ADN dañado. 2. Inhibición de la citocinesis mediante la adición de citocalasina B. 3. La frecuencia de Mn se puntúa sólo en células binucleadas. La parte superior & # x02014 controla las células binucleadas sin Mn, la parte inferior & # x02014 dos células binucleadas con 1 o 6 Mn visibles en el citoplasma.

El CBMN se realiza principalmente en linfocitos de sangre periférica humana para estudiar la formación in vivo de Mn para biomonitoreo o dosimetría biológica, sin embargo, se puede realizar en diferentes linfocitos de otras especies, por ejemplo, roedores, peces, perros, conejos, monos y simios u otros. células de diferente origen [50,51,52]. El CBMN también se utiliza con mucha frecuencia en muestras de sangre in vitro para estudiar los efectos genotóxicos de las sustancias químicas. [6,53,54,55,56,57]. La información sobre las pruebas de genotoxicidad in vitro por MN se recopila, revisa y sistematiza en la Guía 487 de la Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE) [4].

El CBMN proporciona una base integral para la investigación in vitro del potencial de daño cromosómico de las sustancias químicas, dignas de mención, tanto aneugénicas (cambios en el número de cromosomas en la célula causados, por ejemplo, por fumar tabaco, pesticidas) como cambios clastogénicos (aberración estructural causada, por ejemplo, por radiación ionizante amarillo de acridina, benceno, óxido de etileno, arseno, fosfina). Según la directriz de la OCDE, las células deben ser tratadas con compuestos químicos de tres formas diferentes: cultivadas con citocalasina B, cultivadas sin citocalasina B y cultivadas en presencia de un sistema de activación metabólica exógena, generalmente preparada a partir del hígado de roedores (fracción S9). . Es imposible enumerar todas las aplicaciones del CBMN. Ya se han descrito las aplicaciones más importantes de CBMN, pero en la Tabla 4 se mencionan varias más.

Cuadro 4

investigación básica sobre el daño y la reparación del ADN [58,59]
estudios de radiosensibilidad de varios grupos, ya sean sanos o con trastornos genéticos [24,60,61,62]
intenta vincular la radiosensibilidad con la reacción a la radiación de los tejidos normales en personas sometidas a radioterapia [63,64]
pruebas predictivas de enfermedad neoplásica [60,65,66]
caracterizaciones del daño citogenético durante la quimio y radioterapia [67,68]
biomonitoreo del medio ambiente o exposición ocupacional [32,69,70,71].

Caracterización de trastornos CBMN-exposición ocupacional, aunque en la versión básica del ensayo solo se puntúa Mn, el ensayo puede ampliarse puntuando otros biomarcadores, como puentes nucleoplasmáticos, brotes nucleares, ampollas nucleares, células necróticas y / o apoptóticas [32]. Este tipo de ensayo, denominado ensayo de citoma CBMN, proporciona información adicional sobre el daño del ADN y su reparación, citostasis y citotoxicidad [72].

4.2. Ensayo de micronúcleos de eritrocitos y # x02013el más popular en vivo MN

El ensayo de micronúcleos de eritrocitos (EMn) se realizó inicialmente en eritrocitos inmaduros de la médula ósea de ratones y ratas jóvenes [73]. La desventaja del ensayo es que el examen de la médula ósea implica sacrificar la vida de los roedores. Además, en la médula ósea están presentes factores potencialmente de confusión, como otras células nucleadas (células del mosto, granulocitos o diferentes tipos de linfocitos) [74]. La EMn también se realizó en material celular extraído de la médula ósea humana para determinar el daño citogenético después de la radioterapia y la quimioterapia [75,76,77,78].

Debido a la alta invasividad del método, se desarrolló un enfoque alternativo, basado en la evaluación de la frecuencia de Mn en eritrocitos inmaduros en sangre periférica [1,79]. Durante la maduración, las células precursoras de eritrocitos pierden su núcleo, sin embargo, retienen el Mn formado durante la etapa nucleada [2]. Los eritrocitos inmaduros (también llamados reticulocitos o eritrocitos policromáticos) pueden reconocerse fácilmente a partir de los eritrocitos maduros porque todavía contienen ARN en su citoplasma [1]. En la médula ósea, los eritrocitos inmaduros constituyen aproximadamente el 50% de todos los eritrocitos [80,81].

Las células precursoras de eritrocitos humanos presentes en la médula ósea larga de las muestras de control contienen núcleos, probablemente como resultado de la exposición laboral o ambiental o de factores genéticos (Figura 2). Los eritrocitos inmaduros que surgen de las células precursoras también contienen Mn, sin embargo, representan sólo un pequeño porcentaje de todos los eritrocitos en la sangre periférica [81]. Aunque la frecuencia de Mn en los eritrocitos inmaduros es significativamente mayor que en los eritrocitos maduros [1], la selección esplénica, un proceso que elimina eficazmente los eritrocitos micronucleados de la sangre periférica, reduce significativamente la frecuencia de Mn. La selección esplénica se produce en ratas y seres humanos, también en ratones, pero en menor medida [74,82]. Por lo tanto, en humanos, la MN en eritrocitos inmaduros se lleva a cabo solo en individuos a los que se les ha extirpado el bazo [13,83]. Para aumentar la fiabilidad del ensayo, el MN en eritrocitos inmaduros en sangre periférica se ha automatizado y se lleva a cabo mediante citometría de flujo. Con esta técnica se pueden analizar cientos de miles de células en un tiempo confiable, lo que permitió superar problemas con bajo número de células disponibles para análisis y selección esplénica de Mn. La citometría de flujo con ayuda de la puntuación de Mn en eritrocitos se validó tanto en roedores como en seres humanos [82,84,85].

Ensayo de micronúcleos de eritrocitos de mamíferos. (1). El eritrocito inmaduro en la médula ósea contiene núcleo y ARN en su citoplasma. Cuando se induce daño en el ADN in vivo, pueden surgir micronúcleos en el eritrocito nucleado. Cuando se excluye el núcleo durante la maduración de los eritrocitos, el micronúcleo permanece en el citoplasma. (2). En la médula ósea, los eritrocitos inmaduros consisten en alrededor del 50% de todos los eritrocitos. Ocasionalmente, estos eritrocitos inmaduros pueden contener Mn. (3). A veces, los eritrocitos inmaduros se liberan a la sangre periférica, donde constituyen menos del 5% de todos los eritrocitos. Los eritrocitos inmaduros en sangre pueden reconocerse debido a sus receptores de superficie específicos o contenido de ARN. La técnica de citometría de flujo hace que la EMn sea factible en sangre periférica de roedores y humanos.

4.3. MN bucal (BMm) & # x02013 Ensayo maduro pero infrautilizado

Aunque BMm se ha utilizado durante unos 40 años, parece que solo en los últimos años ha ganado más interés. Las primeras publicaciones que describen esta prueba aparecieron en la década de 1980 [86,87]. Sin embargo, la primera publicación del protocolo operativo en Nature Protocols se enmarca en los últimos 10 años, después de la armonización del ensayo por parte del grupo internacional HUMNxl [88,89]. El manganeso surge en la división de las células basales del epitelio oral, pero se observa en las células diferenciadas de la capa queratinizada de la superficie bucal [90,91]. Además del Mn, se pueden analizar varios otros biomarcadores citogenéticos, incluidos los relacionados con la muerte celular, lo que proporciona más información sobre el origen del daño del ADN, la citostasis y la citotoxicidad, de alguna manera análoga al ensayo del citoma CBMN mencionado anteriormente [88,91]. . Este enfoque también se denominó ensayo de citoma de micronúcleo bucal (BMCyt) [88,91,92].

El Mn en las células bucales se forma en el organismo, en tejido epitelial bucal que se divide rápidamente (Figura 3). Aunque las células de la cavidad oral están expuestas a factores genotóxicos o citotóxicos por inhalación e ingestión de alimentos en mayor medida que los linfocitos de sangre periférica, la frecuencia de fondo de Mn en las células bucales es muy baja [93,94]. Por otro lado, los pacientes sometidos a radioterapia de cabeza y cuello pueden servir como control positivo, aunque se deben considerar algunas cuestiones éticas, ya que en su caso la recolección de material es más problemática por lesiones e inflamación de la mucosa oral [88,95 ]. El BMm se utilizó para investigar el impacto de la nutrición, los factores del estilo de vida (como fumar, beber alcohol o masticar betel), la exposición a la genotoxina y la citotoxina. Curiosamente, se encontró una correlación entre la frecuencia de Mn en las células bucales y un mayor riesgo de envejecimiento acelerado, ciertos tipos de cáncer y enfermedades neurodegenerativas [92,96].

Ensayo de micronúcleos bucales. (1) El Mn es inducido in vivo por agentes genotóxicos en tejido epitelial bucal que se divide rápidamente. Las células epiteliales se diferencian y se mueven hacia la capa externa de la mucosa oral. (2) La frecuencia de Mn puede estimarse en frotis de células bucales exfoliadas.

La BMn parece ser ventajosa sobre otros tipos de MN para estudiar cómo los factores genotóxicos afectan a los organismos por inhalación. Es el único método capaz de mostrar efectos genotóxicos de concentraciones moderadas de radón, como las que se encuentran en habitaciones, sótanos o cuevas sin ventilación [14,97]. Además, la sensibilidad de BMn permitió también mostrar los efectos genotóxicos del trabajo en la asistencia sanitaria, donde el personal estaba expuesto a dosis muy bajas de radiación [98]. La BMn está ganando popularidad y probablemente se convertirá en una prueba citogenética estándar, especialmente porque es mínimamente invasiva, fácil de realizar y se toman muestras de células de la cavidad bucal.

4.4. Otros tipos de MN

Ocasionalmente, la MN también se realiza en células distintas de los linfocitos, fibroblastos y células bucales, como las células de la mucosa nasal o las células derivadas de la orina [99,100,101]. Tanto los objetivos de la prueba como el método de ejecución siguen siendo similares a CBMN o BMn, pero estas pruebas no han ganado mucha popularidad hasta ahora.


Formación de micronúcleos, estado proliferativo, muerte celular y daño del ADN en linfocitos humanos tratados con etosuximida

La etosuximida es un bloqueador de los canales de Ca 2+ de tipo T que se ha utilizado como anticonvulsivo para tratar las crisis de ausencia. Debido a que aún no se han informado datos sobre los efectos de citotoxicidad, genotoxicidad y muerte celular de este fármaco, hemos investigado linfocitos humanos tratados con etosuximida con el ensayo CBMN (citoma de micronúcleo bloqueado por citocalasina) de Fenech y electroforesis en gel unicelular (ensayo cometa). Las pruebas nos permitieron examinar la formación de micronúcleos, el estado proliferativo de las células viables, la formación de ampollas nucleares, la formación de puentes nucleoplasmáticos, la muerte celular (ensayo CBMN) y el daño del ADN (ensayo cometa). Los linfocitos se trataron durante 24 h con 25, 50 o 100 µg / ml de etosuximida. Las células utilizadas para el ensayo de CBMN se examinaron inmediatamente o 24 h después del bloqueo de citocalasina. Para el ensayo del cometa, las células se examinaron inmediatamente o 22 h después de 2 h de tratamiento con etosuximida. Los resultados indican que 25 y 50 μg / ml de etosuximida no indujeron la formación de micronúcleos, anomalías nucleares, muerte celular o daño del ADN, ni afectaron la proliferación celular, lo que sugiere que no hay efectos citotóxicos o genotóxicos en tales condiciones experimentales. Sin embargo, bajo tratamiento con 100 μg / ml de etosuximida, se detectó un aumento en la formación de micronúcleos y anomalías nucleares, pero una disminución en la proliferación celular y en el daño del ADN, y ningún cambio en la tasa de muerte celular. Aunque aparentemente contradictorios, los datos obtenidos con la concentración de 100 μg / ml pueden indicar que la inducción de citotoxicidad y genotoxicidad no debe descartarse al considerar la concentración de este fármaco. Los mecanismos subyacentes a la respuesta celular a la etosuximida quedan por explorar.


MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo celular, líneas celulares y reactivos

Para construir líneas celulares que expresan de manera estable H2B-Dendra2, se transfectaron células HEK293T con la construcción LV.CNV.puro.H2B-Dendra2 (un regalo de Jacco van Rheenen, Molecular Pathology, The Netherlands Cancer Institute, The Netherlands) usando X-tremeGENE (Roche ) según el protocolo del fabricante. Después de 2 días, se añadió medio que contenía virus a las células RPE-1 p53kd (un obsequio de Johan Kuiken y Roderick Beijersbergen, Departamento de Medicina Celular y Molecular, Instituto del Cáncer de los Países Bajos), y las células positivas para Dendra2 se clasificaron en fluorescencia verde en 2 semanas después de la infección. Las células RPE-1 que expresan PCNA-mCherry y H2B-eGFP fueron amablemente proporcionadas por Arshad Desai (Instituto Ludwig para la Investigación del Cáncer, EE. UU.). Para producir células RPE-1 JNK-KTR, se transfectaron células HEK293T con pLenti PGK Puro DEST JNKKTRClover (plásmido Addgene # 59151, depositado por Markus Covert Regot et al., 2014) usando X-tremeGENE (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El virus obtenido se añadió a RPE-1 y se realizó la selección del fármaco (puromicina 1 µg / µl) a las 24 h de la infección. Todas las células descritas anteriormente se cultivaron a 37 ° C con 5% de CO2 en medio avanzado Eagle modificado de Dulbecco con mezcla de nutrientes F-12 (DMEM-F12) con Glutamax (GIBCO), suplementado con suero de ternero fetal al 10% (Clontech), 100 U / ml de penicilina (Invitrogen), 100 μg / ml de estreptomicina (Invitrogen) ) y UltraGlutamina 2 mM (Lonza). Para la sincronización del ciclo celular, las células se trataron con timidina 2,5 mM (Sigma) durante 22 hy se liberaron lavando dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS). Todos los inhibidores se disolvieron en DMSO y se utilizaron en las siguientes concentraciones: proTAME, GSK923295 20 μM, NMS-P715 50 nM, anisomicina 480 nM, 50 μM (1 h) e inhibidor VIII de JNK, 10 μM. Se ha demostrado que todas las líneas celulares descritas anteriormente están libres de contaminación por micoplasmas.

Imágenes de lapso de tiempo

Para la obtención de imágenes de células vivas, las células se cultivaron en cubreobjetos con cámara Lab-Tek II (Thermo Science). Las imágenes se adquirieron cada 5, 10 o 15 minutos utilizando un microscopio DeltaVision Elite (precisión aplicada) mantenido a 37 ° C, 5% de CO2 utilizando un objetivo de 20 × 0,75 NA (Olympus) y una cámara Coolsnap HQ2 (Fotometría) con agrupamiento 2 veces. El análisis de imágenes se realizó con el software ImageJ. Para los experimentos de seguimiento de micronúcleos, los micronúcleos preconvertidos se identificaron mediante fluorescencia verde y se fotoconvirtieron mediante el uso de un pulso breve (0,05 s) de un láser de 405 nm en un microscopio Deltavision Elite equipado con un módulo láser X4 (precisión aplicada). Las imágenes de células vivas posteriores se realizaron como se indicó anteriormente. Se utilizó un microscopio automatizado Lionheart FX para los ensayos de importación nuclear (microscopio mantenido a 37 ° C, 5% de CO2 utilizando un objetivo 20 × NA y un CCD Sony, cámara de 1,25 megapíxeles con BioTek binning 2 veces).

Transfección de ARNip

Se transfectó el ARNip ON-TARGETplus SMARTpool dirigido a p53 (Thermo Scientific) utilizando RNAiMAX (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante a una concentración final de 20 nM, 24 h antes del inicio del experimento.

Inmunofluorescencia

Las células se cultivaron en cubreobjetos de vidrio de 10 mm y se fijaron en formaldehído al 3,7% con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios se incubaron a 4ºC durante la noche y los anticuerpos secundarios se incubaron durante 2 ha temperatura ambiente, ambos disueltos en PBS Tween al 0,1%. Se utilizaron los siguientes anticuerpos: Mad1 (1: 500, sc-65494, Santa Cruz Biotechnology), Crest (1: 5000, CS1058, Cortex Biochem), CENP-A (1: 300, ab13939, Abcam), CENP-C ( 1: 600, PD030, MBL), CENP-T (1: 1000, D286-3, MBL), H4K20me1 (1: 2000, Hori et al., 2014). Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 y Alexa Fluor 647 (Molecular Probes) para inmunofluorescencia. Se añadió DAPI a todas las muestras antes del montaje utilizando fluido de montaje Vectashield (Vector Laboratories). Se determinaron los niveles de replicación para células cultivadas en medio que contenía EdU durante el tiempo indicado. Después de la fijación, se visualizó la incorporación de EdU mediante tinción con tampón (Tris-HCl 100 mM pH 8,5, con CuSO 1 mM4) y Alexa Fluor 488 – azide (Life Technologies) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las imágenes se adquirieron en un microscopio DeltaVision Elite (Applied Precision), tomando 200 nm z-apila con un objetivo PlanApo N 60 × NA 1.42 (Olympus) y una cámara Coolsnap HQ2 (Fotometría). Las imágenes se analizaron después de la deconvolución usando SoftWoRx (Applied Precision). Las cifras son proyecciones de máxima intensidad de células enteras. El brillo y el contraste se ajustaron con Photoshop 6.0 (Adobe). Para las tinciones de cinetocoro, dado que todas las proteínas probadas parecían tener niveles más bajos en los micronúcleos, incluidas las proteínas centroméricas, todas las mediciones se normalizaron al promedio de 10 centrómeros (CREST) ​​en el núcleo primario (Fig. 4A, C).


Los cromosomas atrapados en micronúcleos son propensos a errores de segregación

Es probable que el ADN de los micronúcleos se dañe. Cuando el ADN roto de los micronúcleos se reincorpora al núcleo primario, pueden producirse reordenamientos aberrantes, un fenómeno conocido como cromotripsis. Aquí, investigamos cómo actúan las cromátidas de los micronúcleos en divisiones posteriores y cómo esto afecta su destino. Observamos que la mayoría de las cromátidas derivadas de micronúcleos no logran establecer un cinetocoro adecuado en la mitosis, lo que se asocia con problemas en la alineación cromosómica, la segregación y la activación del punto de control del ensamblaje del huso. Sorprendentemente, encontramos que, tras su formación, los micronúcleos ya muestran niveles reducidos de importantes factores de ensamblaje del cinetocoro. Es importante destacar que estos defectos favorecen la exclusión del micronúcleo sobre la reintegración al núcleo primario en varias divisiones. Curiosamente, los defectos observados en los micronúcleos probablemente se superen una vez que los micronúcleos se reincorporen en los núcleos primarios, ya que se propagan más normalmente. Concluimos que la formación de una pequeña entidad nuclear separada representa un mecanismo para que la célula retrase la propagación estable del exceso de cromosomas y / o ADN dañado, al inducir defectos de cinetocoro.

Palabras clave: Micronúcleo de segregación cromosómica aneuploidía.

© 2018. Publicado por The Company of Biologists Ltd.

Declaracion de conflicto de interes

Intereses en competencia Los autores declaran no tener intereses en competencia o financieros.


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