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¿Cómo se elimina un gen de E. coli sin alterar el resto del grupo de genes?

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Estoy familiarizado con el método para construir una colección de Keio usando la eliminación de un solo gen con un casete de antibióticos. Sin embargo, ¿qué sucede cuando hay grupos de genes o ORF superpuestos y aún desea eliminar un solo gen?


Digamos que tenemos el gen A, seguido del gen B para que se superpongan con 100 bases. Si desea eliminar solo el gen A, puede hacer lo siguiente:

  • PCR gen A y clonarlo en un vector
  • PCR del gen B y clonarlo en otro vector
  • Inserte un marcador de resistencia a antibióticos en la región superpuesta de los genes A y B
    • ahora no tienes el gen funcional A y el gen B
  • Transforma tus células solo con el vector que contiene el gen B

Ahora ha alterado solo el gen A pero tiene un gen funcional B.


15.3 Factores de virulencia de patógenos bacterianos y virales

En la sección anterior, explicamos que algunos patógenos son más virulentos que otros. Esto se debe al factor de virulencia único s producidos por patógenos individuales, que determinan la extensión y gravedad de la enfermedad que pueden causar. Los factores de virulencia de un patógeno están codificados por genes que pueden identificarse utilizando los postulados moleculares de Koch. Cuando se inactivan los genes que codifican los factores de virulencia, la virulencia en el patógeno disminuye. En esta sección, examinamos varios tipos y ejemplos específicos de factores de virulencia y cómo contribuyen a cada paso de la patogénesis.

Factores de virulencia para la adhesión

Como se discutió en la sección anterior, los dos primeros pasos en la patogénesis son la exposición y la adhesión. Recuerde que una adhesina es una proteína o glicoproteína que se encuentra en la superficie de un patógeno y que se adhiere a los receptores de la célula huésped. Las adhesinas se encuentran en patógenos bacterianos, virales, fúngicos y protozoarios. Un ejemplo de adhesina bacteriana es la adhesina fimbrial de tipo 1, una molécula que se encuentra en las puntas de las fimbrias de E. coli (ETEC). Recuerde que las fimbrias son cerdas proteicas parecidas a pelos en la superficie celular. La adhesina fimbrial de tipo 1 permite que las fimbrias de las células ETEC se unan a los glicanos manosa expresados ​​en las células epiteliales intestinales. La tabla 15.7 enumera las adhesinas comunes que se encuentran en algunos de los patógenos que hemos discutido o veremos más adelante en este capítulo.

Algunas adhesinas bacterianas y sus sitios de unión al huésped
Patógeno Enfermedad Adhesin Sitio adjunto
Streptococcus pyogenes Faringitis estreptocócica Proteína F Células epiteliales respiratorias
Streptococcus mutans Caries dental Adhesin P1 Dientes
Neisseria gonorrhoeae Gonorrea Pili tipo IV Células epiteliales uretrales
Enterotoxigénico E. coli (ETEC) Diarrea del viajero Fimbrias tipo 1 Células epiteliales intestinales
Vibrio cholerae Cólera Pili de N-metilfenilalanina Células epiteliales intestinales

Enfoque clínico

Parte 3

La presencia de bacterias en la sangre de Michael es un signo de infección, ya que la sangre normalmente es estéril. No hay indicios de que la bacteria haya entrado en la sangre a través de una lesión. En cambio, parece que la puerta de entrada fue la ruta gastrointestinal. Sobre la base de los síntomas de Michael, los resultados de su análisis de sangre y el hecho de que Michael era el único en la familia que comía los hot dogs, el médico sospecha que Michael sufre de un caso de listeriosis.

Listeria monocytogenes , el patógeno intracelular facultativo que causa la listeriosis, es un contaminante común en alimentos listos para el consumo, como fiambres y productos lácteos. Una vez ingeridas, estas bacterias invaden las células epiteliales intestinales y se trasladan al hígado, donde crecen dentro de las células hepáticas. La listeriosis es mortal en aproximadamente una de cada cinco personas sanas normales y las tasas de mortalidad son ligeramente más altas en pacientes con afecciones preexistentes que debilitan la respuesta inmunitaria. Un grupo de genes de virulencia codificados en una isla de patogenicidad es responsable de la patogenicidad de L. monocytogenes. Estos genes están regulados por un factor de transcripción conocido como factor de liberación de cadena peptídica 1 (PrfA). Uno de los genes regulados por PrfA es hyl, que codifica una toxina conocida como listeriolisina O (LLO), que permite que la bacteria escape de las vacuolas al entrar en una célula huésped. Un segundo gen regulado por PrfA es actA, que codifica una proteína de superficie conocida como proteína inductora de ensamblaje de actina (ActA). ActA se expresa en la superficie de Listeria y polimeriza la actina del huésped. Esto permite que la bacteria produzca colas de actina, se mueva por el citoplasma de la célula y se propague de una célula a otra sin salir al compartimento extracelular.

La condición de Michael ha comenzado a empeorar. Ahora está experimentando rigidez en el cuello y hemiparesia (debilidad de un lado del cuerpo). Preocupado por la propagación de la infección, el médico decide realizar pruebas adicionales para determinar qué está causando estos nuevos síntomas.

  • ¿Qué tipo de patógeno causa la listeriosis y qué factores de virulencia contribuyen a los signos y síntomas que experimenta Michael?
  • ¿Es probable que la infección se propague de la sangre de Michael? Si es así, ¿cómo podría esto explicar sus nuevos síntomas?

Vaya al siguiente cuadro de Enfoque clínico. Regrese al cuadro de Enfoque clínico anterior.

Exoenzimas y toxinas bacterianas como factores de virulencia

Después de la exposición y la adhesión, el siguiente paso en la patogénesis es la invasión, que puede involucrar enzimas y toxinas. Muchos patógenos logran la invasión ingresando al torrente sanguíneo, un medio eficaz de diseminación porque los vasos sanguíneos pasan cerca de todas las células del cuerpo. La desventaja de este mecanismo de dispersión es que la sangre también incluye numerosos elementos del sistema inmunológico. Se utilizan varios términos que terminan en –emia para describir la presencia de patógenos en el torrente sanguíneo. La presencia de bacterias en la sangre se llama bacteriemia. La bacteriemia que involucra piógenos (bacterias formadoras de pus) se llama piemia. Cuando se encuentran virus en la sangre, se denomina viremia. El término toxemia describe la condición en la que se encuentran toxinas en la sangre. Si las bacterias están presentes y se multiplican en la sangre, esta condición se llama septicemia.

Los pacientes con septicemia se describen como sépticos, lo que puede provocar un shock, una disminución de la presión arterial que pone en peligro la vida (presión sistólica & lt90 mm Hg) que impide que las células y los órganos reciban suficiente oxígeno y nutrientes. Algunas bacterias pueden causar un shock a través de la liberación de toxinas (factores de virulencia que pueden causar daño tisular) y provocar presión arterial baja. Las bacterias gramnegativas son engullidas por los fagocitos del sistema inmunológico, que luego liberan el factor de necrosis tumoral, una molécula involucrada en la inflamación y la fiebre. El factor de necrosis tumoral se une a los capilares sanguíneos para aumentar su permeabilidad, lo que permite que los líquidos pasen de los vasos sanguíneos a los tejidos y provoquen hinchazón o edema (figura 15.10). Con altas concentraciones de factor de necrosis tumoral, la reacción inflamatoria es grave y se pierde suficiente líquido del sistema circulatorio para que la presión arterial disminuya a niveles peligrosamente bajos. Esto puede tener consecuencias nefastas porque el corazón, los pulmones y los riñones dependen de la presión arterial normal para funcionar correctamente, por lo que pueden producirse fallos multiorgánicos, shock y la muerte.

Exoenzimas

Algunos patógenos producen enzimas extracelulares o exoenzimas s, que les permiten invadir las células huésped y tejidos más profundos. Las exoenzimas tienen una amplia variedad de objetivos. Algunas clases generales de exoenzimas y patógenos asociados se enumeran en la Tabla 15.8. Cada una de estas exoenzimas funciona en el contexto de una estructura de tejido particular para facilitar la invasión o apoyar su propio crecimiento y defenderse del sistema inmunológico. Por ejemplo, la hialuronidasa S, una enzima producida por patógenos como Staphylococcus aureus , Streptococcus pyogenes , y Clostridium perfringens , degrada el glucósido hialuronano (ácido hialurónico), que actúa como cemento intercelular entre las células adyacentes en el tejido conectivo (Figura 15.11). Esto permite que el patógeno pase a través de las capas de tejido en la puerta de entrada y se disemine a otras partes del cuerpo (Figura 15.11).

Algunas clases de exoenzimas y sus objetivos
Clase Ejemplo Función
Glicohidrolasas Hialuronidasa S en Staphylococcus aureus Degrada el ácido hialurónico que une las células para promover la propagación a través de los tejidos.
Nucleasas DNAsa producida por S. aureus Degrada el ADN liberado por las células moribundas (bacterias y células huésped) que pueden atrapar las bacterias, promoviendo así la propagación.
Fosfolipasas Fosfolipasa C de Bacillus Anthracis Degrada la bicapa de fosfolípidos de las células huésped, lo que provoca la lisis celular y degrada la membrana de los fagosomas para permitir el escape al citoplasma.
Proteasas Colagenasa en Clostridium perfringens Degrada el colágeno en el tejido conectivo para promover la propagación.

Nucleasas producidas por patógenos, como la DNAsa producida por S. aureus, degradan el ADN extracelular como medio de escape y propagación a través de los tejidos. A medida que las células bacterianas y del huésped mueren en el sitio de la infección, lisan y liberan su contenido intracelular. El cromosoma de ADN es la más grande de las moléculas intracelulares y masas de ADN extracelular pueden atrapar bacterias y prevenir su propagación. S. aureus produce una ADNasa para degradar la malla de ADN extracelular para que pueda escapar y extenderse a los tejidos adyacentes. Esta estrategia también es utilizada por S. aureus y otros patógenos para degradar y escapar de las redes de ADN extracelular producidas por los fagocitos del sistema inmunológico para atrapar las bacterias.

Las enzimas que degradan los fosfolípidos de las membranas celulares se denominan fosfolipasas. Sus acciones son específicas con respecto al tipo de fosfolípidos sobre los que actúan y dónde escinden enzimáticamente las moléculas. El patógeno responsable del ántrax, B. anthracis, produce fosfolipasa C.Cuando B. anthracis es ingerido por las células fagocíticas del sistema inmunológico, la fosfolipasa C degrada la membrana del fagosoma antes de que pueda fusionarse con el lisosoma, permitiendo que el patógeno escape al citoplasma y se multiplique. Las fosfolipasas también pueden dirigirse a la membrana que encierra el fagosoma dentro de las células fagocíticas. Como se describió anteriormente en este capítulo, este es el mecanismo utilizado por patógenos intracelulares como L. monocytogenes y Rickettsia para escapar del fagosoma y multiplicarse dentro del citoplasma de las células fagocíticas. El papel de las fosfolipasas en la virulencia bacteriana no se limita al escape fagosómico. Muchos patógenos producen fosfolipasas que degradan las membranas celulares y provocan la lisis de las células diana. Estas fosfolipasas están involucradas en la lisis de glóbulos rojos, glóbulos blancos y células tisulares.

Los patógenos bacterianos también producen varias enzimas que digieren proteínas o proteasas. Las proteasas se pueden clasificar según su sustrato diana (p. Ej., Serina proteasas diana de proteínas con el aminoácido serina) o si contienen metales en su sitio activo (p. Ej., Las metaloproteasas de zinc contienen un ión de zinc, que es necesario para la actividad enzimática).

Un ejemplo de una proteasa que contiene un ion metálico es la exoenzima colagenasa. La colagenasa digiere el colágeno, la proteína dominante en el tejido conectivo. El colágeno se puede encontrar en la matriz extracelular, especialmente cerca de las membranas mucosas, los vasos sanguíneos, los nervios y las capas de la piel. Similar a la hialuronidasa, la colagenasa permite que el patógeno penetre y se propague a través del tejido del huésped al digerir esta proteína del tejido conectivo. La colagenasa producida por la bacteria grampositiva. Clostridium perfringens , por ejemplo, permite que la bacteria se abra paso a través de las capas de tejido y luego ingrese y se multiplique en la sangre (septicemia). C. perfringens luego usa toxinas y una fosfolipasa para causar lisis y necrosis celular. Una vez que las células huésped han muerto, la bacteria produce gas fermentando los carbohidratos del músculo. La necrosis generalizada del tejido y el gas que la acompaña son característicos del trastorno conocido como gangrena gaseosa (figura 15.12).

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Dos tipos de muerte celular son la apoptosis y la necrosis. Visite este sitio web para obtener más información sobre las diferencias entre estos mecanismos de muerte celular y sus causas.

Toxinas

Además de las exoenzimas, ciertos patógenos pueden producir toxinas. s, venenos biológicos que ayudan en su capacidad para invadir y causar daño a los tejidos. La capacidad de un patógeno para producir toxinas que causen daño a las células huésped se llama toxigenicidad.

Las toxinas se pueden clasificar como endotoxinas o exotoxinas. El lipopolisacárido (LPS) que se encuentra en la membrana externa de las bacterias gramnegativas se llama endotoxina (Figura 15.13). Durante la infección y la enfermedad, los patógenos bacterianos gramnegativos liberan endotoxina cuando la célula muere, lo que resulta en la desintegración de la membrana, o cuando la bacteria sufre una fisión binaria. El componente lipídico de la endotoxina, el lípido A, es responsable de las propiedades tóxicas de la molécula de LPS. El lípido A se conserva relativamente en diferentes géneros de bacterias gramnegativas, por lo que las propiedades tóxicas del lípido A son similares independientemente del patógeno gramnegativo. De manera similar a la del factor de necrosis tumoral, el lípido A desencadena la respuesta inflamatoria del sistema inmunológico (consulte Inflamación y fiebre). Si la concentración de endotoxina en el cuerpo es baja, la respuesta inflamatoria puede proporcionar al huésped una defensa eficaz contra la infección, por otro lado, las concentraciones altas de endotoxina en la sangre pueden causar una respuesta inflamatoria excesiva, lo que lleva a una caída severa de la presión arterial. , insuficiencia multiorgánica y muerte.

Un método clásico de detección de endotoxinas es mediante el uso de Limulus Prueba de lisado de amebocitos (LAL). En este procedimiento, las células sanguíneas (amebocitos) del cangrejo herradura (Limulus polyphemus) se mezcla con el suero de un paciente. Los amebocitos reaccionarán a la presencia de cualquier endotoxina. Esta reacción se puede observar cromogénicamente (color) o buscando que se produzca coagulación (reacción de coagulación) dentro del suero. Un método alternativo que se ha utilizado es un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) que usa anticuerpos para detectar la presencia de endotoxina.

A diferencia del lípido A tóxico de la endotoxina, la exotoxina s son moléculas de proteínas producidas por una amplia variedad de bacterias patógenas vivas. Aunque algunos patógenos gramnegativos producen exotoxinas, la mayoría son producidas por patógenos grampositivos. Las exotoxinas se diferencian de las endotoxinas en varias otras características clave, que se resumen en la Tabla 15.9. A diferencia de la endotoxina, que estimula una respuesta inflamatoria sistémica general cuando se libera, las exotoxinas son mucho más específicas en su acción y en las células con las que interactúan. Cada exotoxina se dirige a receptores específicos en células específicas y daña esas células a través de mecanismos moleculares únicos. La endotoxina permanece estable a altas temperaturas y requiere calentamiento a 121 ° C (250 ° F) durante 45 minutos para inactivarse. Por el contrario, la mayoría de las exotoxinas son termolábiles debido a su estructura proteica y muchas se desnaturalizan (inactivan) a temperaturas superiores a 41 ° C (106 ° F). Como se discutió anteriormente, la endotoxina puede estimular una respuesta inflamatoria letal a concentraciones muy altas y tiene un LD medido50 de 0,24 mg / kg. Por el contrario, concentraciones muy pequeñas de exotoxinas pueden ser letales. Por ejemplo, la toxina botulínica, que causa botulismo, tiene un LD50 de 0,000001 mg / kg (240.000 veces más letal que la endotoxina).

Comparación de endotoxinas y exotoxinas producidas por bacterias
Característica Endotoxina Exotoxina
Fuente Bacterias Gram-negativo Bacterias grampositivas (principalmente) y gramnegativas
Composición Lípido A componente de lipopolisacárido Proteína
Efecto en el anfitrión Síntomas sistémicos generales de inflamación y fiebre. Daño específico a las células que depende de la focalización de las células mediada por receptores y de los mecanismos de acción específicos
Estabilidad térmica Estable al calor La mayoría son termolábiles, pero algunas son termoestables.
LD50 Elevado Bajo

Las exotoxinas se pueden agrupar en tres categorías según su objetivo: direccionamiento intracelular, alteración de la membrana y superantígenos. El cuadro 15.10 proporciona ejemplos de toxinas bien caracterizadas dentro de cada una de estas tres categorías.

Algunas exotoxinas comunes y patógenos bacterianos asociados
Categoría Ejemplo Patógeno Mecanismo y enfermedad
Toxinas que se dirigen a las células intracelulares Toxina del cólera Vibrio cholerae Activación de la adenilato ciclasa en las células intestinales, lo que provoca un aumento de los niveles de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) y la secreción de líquidos y electrolitos fuera de la célula, lo que provoca diarrea.
Toxina tetánica Clostridium tetani Inhibe la liberación de neurotransmisores inhibidores en el sistema nervioso central, causando parálisis espástica.
Toxina botulínica Clostridium botulinum Inhibe la liberación del neurotransmisor acetilcolina de las neuronas, lo que resulta en parálisis flácida.
Toxina diftérica Corynebacterium diphtheriae Inhibición de la síntesis de proteínas, causando muerte celular.
Toxinas que alteran la membrana Estreptolisina Streptococcus pyogenes Proteínas que se ensamblan en los poros de las membranas celulares, alterando su función y matando la célula.
Neumolisina steotococos neumonia
Alfa-toxina Staphylococcus aureus
Alfa-toxina Clostridium perfringens Fosfolipasas que degradan los fosfolípidos de la membrana celular, alterando la función de la membrana y matando a la célula.
Fosfolipasa C Pseudomonas aeruginosa
Beta-toxina Staphylococcus aureus
Superantígenos Toxina del síndrome de choque tóxico Staphylococcus aureus Estimula la activación excesiva de las células del sistema inmunológico y la liberación de citocinas (mediadores químicos) de las células del sistema inmunológico. El resultado son fiebre, inflamación y shock potencialmente mortales.
Exotoxina mitogénica estreptocócica Streptococcus pyogenes
Toxinas pirogénicas estreptocócicas Streptococcus pyogenes

La toxina diana intracelular s constan de dos componentes: A para la actividad y B para la unión. Por tanto, estos tipos de toxinas se conocen como exotoxinas A-B (Figura 15.14). El componente B es responsable de la especificidad celular de la toxina y media la unión inicial de la toxina a receptores específicos de la superficie celular. Una vez que la toxina A-B se une a la célula huésped, entra en la célula por endocitosis y queda atrapada en una vacuola. Las subunidades A y B se separan a medida que la vacuola se acidifica.Luego, la subunidad A ingresa al citoplasma celular e interfiere con la función celular interna específica a la que se dirige.

Cuatro ejemplos únicos de toxinas A-B son las toxinas difteria, cólera, botulínica y tétanos. La toxina diftérica es producida por la bacteria grampositiva. Corynebacterium diphtheriae , el agente causante de la difteria nasofaríngea y cutánea. Una vez que la subunidad A de la toxina diftérica se separa y obtiene acceso al citoplasma, facilita la transferencia de difosfato de adenosina (ADP) -ribosa a una proteína de factor de elongación (EF-2) que se necesita para la síntesis de proteínas. Por lo tanto, la toxina diftérica inhibe la síntesis de proteínas en la célula huésped y finalmente la mata (Figura 15.15).

La toxina del cólera es una enterotoxina producida por la bacteria gramnegativa. Vibrio cholerae y está compuesto por una subunidad A y cinco subunidades B. El mecanismo de acción de la toxina del cólera es complejo. Las subunidades B se unen a receptores en la célula epitelial intestinal del intestino delgado. Después de ingresar al citoplasma de la célula epitelial, la subunidad A activa una proteína G intracelular. La proteína G activada, a su vez, conduce a la activación de la enzima adenil ciclasa, que comienza a producir un aumento en la concentración de AMP cíclico (una molécula mensajera secundaria). El aumento de cAMP altera la fisiología normal de las células epiteliales intestinales y hace que segreguen cantidades excesivas de líquido y electrolitos en la luz del tracto intestinal, lo que da como resultado una diarrea grave en "heces de agua de arroz" característica del cólera.

La toxina botulínica (también conocida como botox) es una neurotoxina producida por la bacteria grampositiva. Clostridium botulinum . Es la sustancia más agudamente tóxica conocida hasta la fecha. La toxina se compone de una subunidad A ligera y una subunidad B de la cadena proteica pesada. La subunidad B se une a las neuronas para permitir que la toxina botulínica ingrese a las neuronas en la unión neuromuscular. La subunidad A actúa como una proteasa, escindiendo las proteínas involucradas en la liberación neuronal de acetilcolina, una molécula neurotransmisora. Normalmente, las neuronas liberan acetilcolina para inducir las contracciones de las fibras musculares. La capacidad de la toxina para bloquear la liberación de acetilcolina da como resultado la inhibición de las contracciones musculares, lo que conduce a la relajación muscular. Esto tiene el potencial de dejar de respirar y causar la muerte. Debido a su acción, las bajas concentraciones de botox se utilizan para procedimientos cosméticos y médicos, incluida la eliminación de arrugas y el tratamiento de la vejiga hiperactiva.

Enlace al aprendizaje

Haga clic en este enlace para ver una animación de cómo funciona la toxina del cólera.

Haga clic en este enlace para ver una animación de cómo funciona la toxina botulínica.

Otra neurotoxina es la toxina del tétanos, que es producida por la bacteria grampositiva. Clostridium tetani . Esta toxina también tiene una subunidad A ligera y una subunidad B de cadena proteica pesada. A diferencia de la toxina botulínica, la toxina del tétanos se une a las interneuronas inhibidoras, que son responsables de la liberación de los neurotransmisores inhibidores glicina y ácido gamma-aminobutírico (GABA). Normalmente, estos neurotransmisores se unen a las neuronas en la unión neuromuscular, lo que inhibe la liberación de acetilcolina. La toxina del tétanos inhibe la liberación de glicina y GABA de la interneurona, lo que resulta en una contracción muscular permanente. El primer síntoma suele ser rigidez de la mandíbula (trismo). Siguen espasmos musculares violentos en otras partes del cuerpo, que generalmente culminan con insuficiencia respiratoria y muerte. La figura 15.16 muestra las acciones de las toxinas botulínica y tetánica.

Las toxinas que alteran la membrana afectan la función de la membrana celular ya sea formando poros o alterando la bicapa de fosfolípidos en las membranas de la célula huésped. Dos tipos de exotoxinas que alteran la membrana son la hemolisina s y leucocidinas, que forman poros en las membranas celulares, provocando fugas del contenido citoplásmico y lisis celular. Originalmente se pensó que estas toxinas se dirigían a los glóbulos rojos (eritrocitos) y los glóbulos blancos (leucocitos), respectivamente, pero ahora sabemos que también pueden afectar a otras células. La bacteria grampositiva Streptococcus pyogenes produce estreptolisinas, hemolisinas solubles en agua que se unen a los restos de colesterol en la membrana de la célula huésped para formar un poro. Los dos tipos de estreptolisinas, O y S, se clasifican por su capacidad para causar hemólisis en los eritrocitos en ausencia o presencia de oxígeno. La estreptolisina O no es activa en presencia de oxígeno, mientras que la estreptolisina S lo es en presencia de oxígeno. Otras toxinas importantes que alteran las membranas formadoras de poros incluyen la toxina alfa de Staphylococcus aureus y neumolisina de steotococos neumonia .

Las fosfolipasas bacterianas son toxinas que alteran la membrana. s que degradan la bicapa de fosfolípidos de las membranas celulares en lugar de formar poros. Ya hemos hablado de las fosfolipasas asociadas con B. anthracis, L. pneumophila, y Rickettsia especies que permiten que estas bacterias efectúen la lisis de los fagosomas. Estas mismas fosfolipasas también son hemolisinas. Otras fosfolipasas que funcionan como hemolisinas incluyen la toxina alfa de Clostridium perfringens , fosfolipasa C de P. aeruginosay toxina beta de Staphylococcus aureus.

Algunas cepas de S. aureus también producen una leucocidina llamada leucocidina Panton-Valentine (PVL). La PVL consta de dos subunidades, S y F. El componente S actúa como la subunidad B de una exotoxina A-B ya que se une a los glicolípidos de la membrana plasmática externa de las células animales. El componente F actúa como la subunidad A de una exotoxina A-B y lleva la actividad enzimática. La toxina se inserta y se ensambla en un poro de la membrana. Los genes que codifican PVL están presentes con mayor frecuencia en S. aureus cepas que causan infecciones de la piel y neumonía. La PVL promueve las infecciones de la piel al causar edema, eritema (enrojecimiento de la piel debido a la dilatación de los vasos sanguíneos) y necrosis de la piel. También se ha demostrado que la PVL causa neumonía necrosante. La PVL promueve efectos proinflamatorios y citotóxicos sobre los leucocitos alveolares. Esto da como resultado la liberación de enzimas de los leucocitos que, a su vez, causan daño al tejido pulmonar.

La tercera clase de exotoxinas es el superantígeno. s. Se trata de exotoxinas que desencadenan una estimulación excesiva e inespecífica de las células inmunitarias para secretar citocinas (mensajeros químicos). La producción excesiva de citocinas, a menudo llamada tormenta de citocinas, provoca una fuerte respuesta inmunitaria e inflamatoria que puede causar fiebre alta, presión arterial baja, insuficiencia multiorgánica, shock y muerte que ponen en peligro la vida. El superantígeno prototipo es la toxina del síndrome de choque tóxico de S. aureus. La mayoría de los casos de síndrome de choque tóxico están asociados con la colonización vaginal por agentes productores de toxinas. S. aureus sin embargo, en las mujeres que menstrúan, también puede ocurrir la colonización de otras partes del cuerpo. Algunas cepas de Streptococcus pyogenes también producen superantígenos que se denominan exotoxinas mitogénicas estreptocócicas y toxinas pirogénicas estreptocócicas.

Verifica tu entendimiento

  • Describe cómo las exoenzimas contribuyen a la invasión bacteriana.
  • Explique la diferencia entre exotoxinas y endotoxinas.
  • Nombra las tres clases de exotoxinas.

Factores de virulencia para la supervivencia en el huésped y la evasión inmune

Evadir el sistema inmunológico también es importante para la invasión. Las bacterias utilizan una variedad de factores de virulencia para evadir la fagocitosis por parte de las células del sistema inmunológico. Por ejemplo, muchas bacterias producen cápsulas, que se utilizan en la adhesión, pero también ayudan en la evasión inmunológica al prevenir la ingestión por parte de los fagocitos. La composición de la cápsula evita que las células inmunitarias puedan adherirse y luego fagocitar la célula. Además, la cápsula hace que la célula bacteriana sea mucho más grande, lo que dificulta que las células inmunitarias se traguen al patógeno (Figura 15.17). Una bacteria productora de cápsulas notable es el patógeno grampositivo. steotococos neumonia , que causa neumonía neumocócica, meningitis, septicemia y otras infecciones del tracto respiratorio. Cepas encapsuladas de S. pneumoniae son más virulentas que las cepas no encapsuladas y es más probable que invadan el torrente sanguíneo y causen septicemia y meningitis.

Algunos patógenos también pueden producir proteasas para protegerse contra la fagocitosis. Como se describe en Adaptive Specific Host Defenses, el sistema inmunológico humano produce anticuerpos que se unen a moléculas de superficie que se encuentran en bacterias específicas (por ejemplo, cápsulas, fimbrias, flagelos, LPS). Esta unión inicia la fagocitosis y otros mecanismos de eliminación y eliminación de antibacterianos. Las proteasas combaten la destrucción y eliminación mediadas por anticuerpos al atacar y digerir las moléculas de anticuerpos (figura 15.17).

Además de las cápsulas y proteasas, algunos patógenos bacterianos producen otros factores de virulencia que les permiten evadir el sistema inmunológico. Las fimbrias de ciertas especies de Estreptococo contienen proteína M, que altera la superficie de Estreptococo e inhibe la fagocitosis bloqueando la unión de las moléculas del complemento que ayudan a los fagocitos a ingerir patógenos bacterianos. La bacteria acidorresistente Tuberculosis micobacteriana (el agente causante de la tuberculosis) produce una sustancia cerosa conocida como ácido micólico en su envoltura celular. Cuando es engullido por fagocitos en el pulmón, la capa protectora de ácido micólico permite que la bacteria resista algunos de los mecanismos de muerte dentro del fagolisosoma.

Algunas bacterias producen factores de virulencia que promueven la infección mediante la explotación de moléculas producidas naturalmente por el huésped. Por ejemplo, la mayoría de las cepas de Staphylococcus aureus producen la exoenzima coagulasa, que aprovecha el mecanismo natural de la coagulación de la sangre para evadir el sistema inmunológico. Normalmente, la coagulación de la sangre se desencadena en respuesta al daño de los vasos sanguíneos. Las plaquetas comienzan a taponar el coágulo y se produce una cascada de reacciones en las que el fibrinógeno, una proteína soluble producida por el hígado, se escinde en fibrina. La fibrina es una proteína insoluble similar a un hilo que se une a las plaquetas sanguíneas, se entrecruza y se contrae para formar una malla de plaquetas y glóbulos rojos agrupados. El coágulo resultante evita una mayor pérdida de sangre de los vasos sanguíneos dañados. Sin embargo, si las bacterias liberan coagulasa en el torrente sanguíneo, la cascada de fibrinógeno a fibrina se activa en ausencia de daño en los vasos sanguíneos. El coágulo resultante recubre la bacteria en fibrina, protegiendo a la bacteria de la exposición a las células inmunes fagocíticas que circulan en el torrente sanguíneo.

Mientras que la coagulasa hace que la sangre se coagule, las quinasas tienen el efecto contrario al desencadenar la conversión de plasminógeno en plasmina, que participa en la digestión de los coágulos de fibrina. Al digerir un coágulo, las quinasas permiten que los patógenos atrapados en el coágulo escapen y se propaguen, de manera similar a la forma en que la colagenasa, la hialuronidasa y la DNAsa facilitan la propagación de la infección. Los ejemplos de cinasas incluyen estafiloquinasas y estreptoquinasas, producidas por Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes , respectivamente. Es intrigante que S. aureus puede producir coagulasa para promover la coagulación y estafiloquinasa para estimular la digestión de los coágulos. La acción de la coagulasa proporciona una barrera protectora importante del sistema inmunológico, pero cuando los suministros de nutrientes disminuyen u otras condiciones indican la necesidad de que el patógeno escape y se propague, la producción de estafiloquinasa puede iniciar este proceso.

Un último mecanismo que los patógenos pueden usar para protegerse contra el sistema inmunológico se llama variación antigénica, que es la alteración de las proteínas de la superficie para que el sistema inmunológico del huésped ya no reconozca un patógeno. Por ejemplo, la bacteria Borrelia burgdorferi , el agente causante de la enfermedad de Lyme, contiene una lipoproteína de superficie conocida como VlsE. Debido a la recombinación genética durante la replicación y reparación del ADN, esta proteína bacteriana sufre una variación antigénica. Cada vez que se presenta fiebre, la proteína VlsE en B. burgdorferi puede diferir tanto que los anticuerpos contra secuencias previas de VlsE no son eficaces. Se cree que esta variación en el VlsE contribuye a la capacidad B. burgdorferi causar una enfermedad crónica. Otro patógeno bacteriano humano importante que utiliza la variación antigénica para evitar el sistema inmunológico es Neisseria gonorrhoeae , que causa la gonorrea, una enfermedad de transmisión sexual. Esta bacteria es bien conocida por su capacidad de sufrir una variación antigénica de sus pili de tipo IV para evitar las defensas inmunitarias.

Verifica tu entendimiento

  • Nombra al menos dos formas en las que una cápsula brinda protección contra el sistema inmunológico.
  • Además de las cápsulas, mencione otros dos factores de virulencia utilizados por las bacterias para evadir el sistema inmunológico.

Enfoque clínico

Resolución

Sobre la base de los síntomas de rigidez en el cuello y hemiparesia de Michael, el médico sospecha que la infección puede haberse extendido a su sistema nervioso. El médico decide ordenar una punción lumbar para buscar cualquier bacteria que pueda haber invadido las meninges y el líquido cefalorraquídeo (LCR), que normalmente sería estéril. Para realizar la punción lumbar, la parte baja de la espalda de Michael se limpia con un antiséptico de yodo y luego se cubre con una sábana esterilizada. La aguja se retira asépticamente del embalaje de plástico sellado del fabricante con las manos enguantadas del médico. Se inserta la aguja y se extrae un pequeño volumen de líquido en un tubo de muestra adjunto. El tubo se retira, se tapa y se coloca una etiqueta preparada con los datos de Michael. Esta muestra STAT (se requiere análisis urgente o inmediato) se divide en tres tubos estériles separados, cada uno con 1 ml de LCR. Estos tubos se llevan inmediatamente al laboratorio del hospital, donde se analizan en los departamentos de química clínica, hematología y microbiología. Los resultados preliminares de los tres departamentos indican que se está produciendo una infección cerebroespinal, y el departamento de microbiología informó la presencia de un bacilo grampositivo en el LCR de Michael.

Estos resultados confirman lo que su médico sospechaba: los nuevos síntomas de Michael son el resultado de la meningitis, una inflamación aguda de las membranas que protegen el cerebro y la médula espinal. Debido a que la meningitis puede poner en peligro la vida y debido a que la primera terapia con antibióticos no fue eficaz para prevenir la propagación de la infección, a Michael se le prescribe un tratamiento agresivo de dos antibióticos, ampicilina y gentamicina, para administrar por vía intravenosa. Michael permanece en el hospital durante varios días para recibir atención de apoyo y en observación. Después de una semana, se le permite regresar a casa para reposo en cama y antibióticos orales. Después de 3 semanas de este tratamiento, se recupera por completo.

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Virulencia viral

Aunque los patógenos virales no son similares a los patógenos bacterianos en términos de estructura, algunas de las propiedades que contribuyen a su virulencia son similares. Los virus utilizan adhesinas para facilitar la adhesión a las células del huésped, y ciertos virus envueltos dependen de la variación antigénica para evitar las defensas inmunitarias del huésped. Estos factores de virulencia se analizan con más detalle en las siguientes secciones.

Adhesinas virales

Uno de los primeros pasos en cualquier infección viral es la adhesión del virus a receptores específicos en la superficie de las células. Este proceso está mediado por adhesinas que forman parte de la cápside viral o envoltura de la membrana. La interacción de las adhesinas virales con receptores celulares específicos define el tropismo (focalización preferencial) de los virus para células, tejidos y órganos específicos del cuerpo. La proteína de pico hemaglutinina que se encuentra en el virus de la influenza es un ejemplo de una adhesina viral que permite que el virus se una al ácido siálico en la membrana de las células respiratorias e intestinales del huésped. Otra adhesina viral es la glicoproteína gp20, que se encuentra en el VIH. Para que el VIH infecte las células del sistema inmunológico, debe interactuar con dos receptores en la superficie de las células. La primera interacción implica la unión entre gp120 y el marcador celular CD4 que se encuentra en algunas células esenciales del sistema inmunológico. Sin embargo, antes de que pueda ocurrir la entrada viral en la célula, debe ocurrir una segunda interacción entre gp120 y uno de los dos receptores de quimiocinas (CCR5 y CXCR4). La tabla 15.11 enumera las adhesinas para algunos patógenos virales comunes y los sitios específicos a los que estas adhesinas permiten que los virus se adhieran.

Algunas adhesinas virales y sus sitios de fijación del anfitrión
Patógeno Enfermedad Adhesin Sitio adjunto
Virus de la gripe Influenza Hemaglutinina Ácido siálico de las células respiratorias e intestinales.
Virus del herpes simple I o II Herpes oral, herpes genital Glicoproteínas gB, gC, gD Sulfato de heparán en las superficies mucosas de la boca y los genitales
Virus de inmunodeficiencia humana VIH / SIDA Glicoproteína gp120 CD4 y CCR5 o CXCR4 de las células del sistema inmunológico

Variación antigénica en virus

La variación antigénica también ocurre en ciertos tipos de virus con envoltura, incluidos los virus de la influenza, que exhiben dos formas de variación antigénica: deriva antigénica y desplazamiento antigénico (Figura 15.18). La deriva antigénica es el resultado de mutaciones puntuales que provocan cambios leves en las proteínas espiga hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N). Por otro lado, el cambio antigénico es un cambio importante en las proteínas de pico debido al reordenamiento de genes. Este reordenamiento para el cambio antigénico ocurre típicamente cuando dos virus de influenza diferentes infectan al mismo hospedador.

La tasa de variación antigénica en los virus de la influenza es muy alta, lo que dificulta que el sistema inmunológico reconozca las muchas cepas diferentes de virus de la influenza. Aunque el cuerpo puede desarrollar inmunidad a una cepa a través de la exposición natural o la vacunación, la variación antigénica da como resultado la aparición continua de nuevas cepas que el sistema inmunológico no reconocerá. Ésta es la razón principal por la que las vacunas contra el virus de la influenza deben administrarse anualmente. La vacuna contra la influenza de cada año brinda protección contra las cepas más prevalentes para ese año, pero las cepas nuevas o diferentes pueden ser más prevalentes el año siguiente.

Enlace al aprendizaje

Para obtener otra explicación de cómo se producen el cambio y la deriva antigénica, mire este video.


Genética - Revisión del examen IV

Utilice enfoques tanto experimentales como bioinformáticos para identificar y analizar elementos funcionales que regulan la expresión de genes humanos (por ejemplo, sitios de inicio de la transcripción, promotores, potenciadores).

Estudia la expresión de genes por un genoma tanto cualitativamente (identifica lo que se expresa y lo que no se expresa) como cuantitativamente (midiendo diferentes niveles de expresión).

Proporciona información sobre la estructura / función de una proteína, modificaciones postraduccionales, interacciones proteína-proteína, proteína-nucleótido, proteína-metabolito, etc.

Funcionan como reguladores cis porque funcionan cuando son adyacentes a los genes que regulan.

Algunos FT se expresan de formas específicas de tejido o de formas específicas de tiempo.

También asociados con el complejo TFIID están

13 proteínas llamadas TAF (factores asociados a TATA).

La transcripción de estos genes, que transportan la galactosa al interior de la célula y la metabolizan, es inducible.

En ausencia de galactosa, Gal4p se une al UAS. Gal80p se une a Gal4p y cubre su dominio de activación de la transcripción (TAD).

El empalme alternativo permite muchas formas de ARNm final (y proteína ∴) a partir del mismo pre-ARNm. Las mutaciones que afectan la vía de empalme causan varias enfermedades genéticas.

21-23 ribonucleótidos de longitud) generados por Dicer.

Estos ARN tienen sus propios genes y se transcriben pero NO se traducen.

Drosha escinde los vástagos de priRNA en precursores de miRNA más cortos llamados pre-miRNA.


Examen de microbiología 2

2) Transducción- Transferencia de ADN por un virus, NO es necesario el contacto de célula a célula.

La célula donante original está muerta.

3) Conjugación: transferencia de ADN de la célula del donante al receptor por contacto de célula a célula

2) Competencia_ Es la etapa en la que las bacterias pueden absorber el ADN del medio ambiente.

2) Recombinación: si el ADN es lineal, debe incorporarse al genoma de las células hospedadoras para que sea retenido.

El ADN entrante debe ser similar en secuencia al ADN del huésped.

El ADN entrante reemplaza al ADN del huésped.

R: Forma no patógena, no encapsulada.

R- No virulento (ratón vivo)
S- Virulento (ratón muerto)
Heated Killed S (Ratón vivo)

El principio de transformación fue la cápsula de polisacárido.

1) Tratamiento químico: tratamiento de choque frío y calcio seguido de choque térmico y choque frío.

El frío y los productos químicos debilitan la pared celular y ayudan a que el ADN se adhiera a la superficie.

_ Calcio = + Carga, el ADN es negativo y la superficie celular es negativa, disminuye las repulsiones electrostáticas.

La carga de la membrana permite la formación de poros ya que actúan como condensadores.

Y los fragmenta a una nueva célula receptora y se transforma la que tiene la información genética.

A una densidad celular alta, se activa el sistema de competencia.

Las células encienden su T6SS y comienzan a perforar otras células.

Las células no inmunes se lisarán.

Plásmido- Molécula circular de ADN que se replica a sí misma.

Se encuentra naturalmente en muchas bacterias.

Fuente de genes resistentes a antibióticos.

La mayoría de las partículas virales resultantes llevarán ADN del virus.

En general, solo 1 de cada 10,000 transporta partículas de virus que solo transportan ADN bacteriano por error (0.01)

Transducción generalizada (ejemplo P1: fago)

Cualquier gen bacteriano en particular 1 de cada 500,000 virus. (. 0002)

2) Un fago ocasional empaqueta células bacterianas.

3) El fago con ADN bacteriano infecta otras células.

1) Lamda infecta a E. Coli e inserta su ADN viral en un sitio específico del cromosoma bacteriano = Prophage

2) Normalmente, cuando la E. Coli está dañada, el fago lamda escinde su propio ADN y replica más fagos para infectar otras células.

3) A veces, el ADN de Lamda se corta incorrectamente y parte del ADN bacteriano se toma junto con el huésped.

4) Las partículas de Lamda recién replicadas infectan la célula huésped e infectan una nueva célula, el ADN viral más una porción de los cromosomas del huésped.

La inserción ocurre en sitios específicos del cromosoma bacteriano.

Secuencia de inserción: manchas que tienen una secuencia de ADN casi idéntica entre el plásmido F y el cromosoma bacteriano.

E. coli tiene 19 sitios donde puede integrarse en el genoma de las células huésped.

Cepa que tiene el plásmido F incorporado en su genoma. (Cromosoma Hfr)

Permite la transferencia de alta frecuencia de genes de cromosomas bacterianos a la célula receptora.

Considerada una célula donante porque tiene los genes para la transferencia. (tra)

Conjugación entre Hfr y celda y celda F-

El lado de la punta de flecha del plásmido F es el que se transfiere primero, seguido del cromosoma, seguido del plásmido restante.


Afiliaciones

Tim van Opijnen está en el Departamento de Biología, Boston College, 140 Commonwealth Avenue, 420 Higgins Hall, Chestnut Hill, Massachusetts 02467, EE. UU.

Andrew Camilli trabaja en el Instituto Médico Howard Hughes y en el Departamento de Biología Molecular y Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Tufts, 136 Harrison Avenue, Boston, Massachusetts 02111, EE. UU.

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Autores correspondientes


TRANSCRIPCIÓN

La expresión genética está íntimamente relacionada con la organización de la cromatina. El RNAP debe obtener acceso al ADN genómico que está organizado en nucleosomas, y los nucleosomas posicionados regulan el programa de transcripción a nivel de todo el genoma. Por tanto, es fundamental comprender los mecanismos de transcripción a través de nucleosomas.

Estudios pioneros de Studitsky et al. (95) establecieron que el fago SP6 RNAP se transcribe de manera eficiente a través de un nucleosoma, revelando que el nucleosoma podría transferirse en cis en el ADN detrás de la polimerasa en movimiento. En el modelo de bucle de ADN, la RNAP EC dobla el ADN lo suficiente para facilitar la formación de nuevos contactos nucleosoma-ADN detrás de la EC. A medida que la CE separa el ADN de la superficie del nucleosoma, los contactos de histona recién expuestos se transfieren al ADN desnudo presente detrás de la CE progresiva (95).

Reconstitución de la transcripción in vitro por S. cerevisiae La ARN polimerasa III (pol III) confirmó que el mecanismo intermedio en bucle de ADN también era válido para las RNAP eucariotas (96). Es poco probable que Pol III, una enzima que transcribe genes de ARNt y ARNt relativamente cortos, transcriba un gran número de nucleosomas in vivo. Sin embargo, in vitro, la pol III se transcribe a través de un nucleosoma de una manera análoga a la de los fagos RNAP (96).

¿El RNAP interrumpe activamente los nucleosomas?

En eucariotas, la ARN polimerasa II (pol II) transcribe el ARNm y es posible que deba enfrentarse con frecuencia a las barreras de los nucleosomas. Sin embargo, in vitro, los nucleosomas fueron una barrera potente para la transcripción de pol II humana y de levadura (11, 50, 51, 55). Además, el mecanismo de transcripción y el destino de los nucleosomas difirieron notablemente en comparación con lo que se observó con los RNAP de fagos más simples (50, 55).

Bustamante y sus colegas (8, 42) emplearon un ensayo de pinzas ópticas de una sola molécula de alta resolución para estudiar el mecanismo de cómo la pol II atraviesa la barrera del nucleosoma. El estudio utilizó un enfoque de trampa óptica dual como se ilustra en la Figura 6. Se fijó una perla de poliestireno al extremo de una molécula de ADN mediante una interacción digoxigenina-antidigoxigenina. Se montó una pol II EC y se fijó a una segunda perla recubierta de estreptavidina. Se ensambló un solo nucleosoma en una secuencia de ADN de Widom 601 de posicionamiento fuerte aguas abajo del promotor RNAP (Figura 6a ). Las reacciones se iniciaron luego mediante la adición de los cuatro rNTP, y la transcripción por pol II se reveló como un cambio en la longitud del ADN entre las dos perlas.

Un ensayo de trampa óptica para investigar la transcripción de la ARN polimerasa II (RNAP II) más allá de un nucleosoma. (a) Un esquema de la construcción de ADN utilizada en este estudio. Un extremo del ADN se fijó a una perla de poliestireno mediante una interacción DIG & # x02013anti-DIG. La pol II biotinilada se ensambló en un promotor (azul) y se fija a una segunda perla recubierta de estreptavidina. Se reconstituyó un nucleosoma en la secuencia de ADN de Widom 601 de posicionamiento de nucleosoma fuerte (marrón). (B) Una ilustración de la configuración experimental. La transcripción de RNAP se controló como un cambio en la longitud del ADN entre las dos trampas ópticas. (C) Rastros de transcripción de pol II individuales en función de la concentración de NaCl. A bajas sales, pol II se detiene en la barrera del nucleosoma. A medida que aumenta la concentración de NaCl, la pol II se detiene transitoriamente y finalmente se transcribe más allá del nucleosoma. (D ) Un histograma de probabilidad de detención dependiente de nucleosomas. La polimerasa se detiene cuando se encuentra con el nucleosoma, pero puede transcribir interacciones pasadas de histona-ADN transitoriamente interrumpidas a concentraciones de sal más altas. (CD ) Las trazas de transcripción en el ADN desnudo se muestran en negro Las trazas de transcripción en el ADN con nucleosomas se muestran en colores. Las regiones sombreadas de los gráficos representan la ubicación de la secuencia de posicionamiento del nucleosoma. Abreviaturas: EC, complejo de elongación DIG, digoxigenina.

Como era de esperar, la transcripción en ADN desnudo está sujeta a pausas y retroceso de la EC de RNAP (59, 75). Sin embargo, la propensión a la pausa pol II y la duración de las pausas aumentaron notablemente a medida que la polimerasa se acercó al nucleosoma, y ​​Pol II no pudo transcribir más allá del nucleosoma en condiciones bajas de NaCl (42) (Figura 6).C ). A concentraciones más altas de NaCl, donde las interacciones electrostáticas nucleosoma-ADN se debilitan significativamente, la transcripción podría avanzar más allá del nucleosoma, aunque con velocidades reducidas (42) (Figura 6).

Los datos son consistentes con un modelo en el que pol II actuó como un trinquete que invade un nucleosoma desenvuelto espontáneamente, pero es inconsistente con modelos que invocan la disrupción dependiente de pol II activa de los contactos histona-ADN (42). La pausa de la polimerasa aumentó significativamente a medida que la CE se acercó al eje de la díada del nucleosoma Los experimentos de desenvolvimiento de nucleosomas de una sola molécula de alta resolución han indicado que esta región tiene interacciones electrostáticas de histona-ADN particularmente fuertes y que estas interacciones se interrumpen con fuerzas iónicas más altas (39) . Al alcanzar el eje de la díada del nucleosoma, pol II retrocede (ver más abajo) o continúa la transcripción a través del resto del nucleosoma. Es importante destacar que los datos descartaron un modelo en el que pol II utilizó la energía de la hidrólisis de NTP para desenrollar activamente el nucleosoma, más bien parece que pol II espera a que el nucleosoma se desenrede espontáneamente (42).

La barrera del nucleosoma a la transcripción se analizó más a fondo en términos de las contribuciones individuales de las interacciones histona-ADN, la secuencia de ADN subyacente y las colas de histonas (8). Bustamante y sus colegas demostraron que cada uno de estos componentes de la barrera del nucleosoma tiene un efecto profundo y distinto en la tasa de transcripción a través de un nucleosoma. La eliminación de las colas de histonas estimuló la transcripción más allá de un nucleosoma al aumentar la tasa de envolvimiento-desenvolvimiento espontáneo de histona-ADN. Por el contrario, la secuencia de ADN subyacente puede causar una pausa en la pol II, y estas pausas se amplifican en una barrera de nucleosoma. Se descubrió que la transcripción de ARN naciente previene el retroceso de la pol II, y la eliminación de la transcripción con Rnasa A reduce drásticamente la transcripción a través de un nucleosoma (8).

La fuerza de la barrera del nucleosoma a la transcripción se ve fuertemente afectada por las interacciones histona-ADN. Este punto de vista está respaldado por el hallazgo de que una mutación de un solo punto en el hi-stone H3 podría rescatar células de levadura que carecían de un factor de remodelación de la cromatina (SWI / SNF) esencial (54). Esta mutación, conocida como pecado (Dependiente de Swi-IN), interrumpe una fuerte interacción nucleosoma-ADN, lo que permite un desplazamiento más fácil de los nucleosomas incluso en ausencia del remodelador de cromatina SWI / SNF (54, 73). Es importante destacar que la transcripción por humanos pol II fue significativamente más eficiente a través de pecado nucleosomas que los nucleosomas de tipo salvaje, e incluso se estimuló hasta niveles cercanos al ADN desnudo mediante la adición de los factores de elongación de la transcripción TFIIS y TFIIF (44, 63). Cuando se examina a nivel de una sola molécula, pecado las mutaciones en H3 y H4 estimularon la transcripción a través de un nucleosoma al disminuir la tasa de reenvoltura espontánea de histona-ADN (8). Por tanto, la fuerza de las interacciones histona-ADN juega un papel clave en la modulación de la transcripción in vitro e in vivo.

El destino del nucleosoma también se ha investigado mediante el uso de imágenes AFM de una sola molécula. La tasa de transcripción puede dictar el destino de los nucleosomas (9). La transcripción rápida de RNAP facilita la disociación del nucleosoma al no dejar tiempo suficiente para que el nucleosoma desenvuelto se transfiera detrás del RNAP. Para pol II de transcripción más lenta, la interrupción de H2A / H2B puede resultar en un hexasoma que se deposita detrás de la EC (9). Estas observaciones pueden explicar las diferencias en la pérdida de histonas observadas entre los RNAP de fagos de transcripción rápida y la pol II (95), y están de acuerdo con la evidencia in vivo del intercambio rápido de H2A / H2B en genes moderadamente transcritos (ver más abajo) (56, 58).

Un RNAP final ayuda a superar las barreras de nucleosomas

El retroceso por parte de la RNAP EC es una característica universal de todas las RNAP y puede interferir con la transcripción de los obstáculos de las proteínas y dar como resultado la inestabilidad del genoma (19, 75). En procariotas, cuatro mecanismos principales pueden rescatar un EC RNAP retrocedido: (a) La traducción de la transcripción incipiente evita el retroceso de RNAP (83) (B) factores como greA / greB rescatan EC estancadas al recortar el mensaje retrocedido para realinear el extremo del ARNm 3 & # x02032-OH con el sitio catalítico de RNAP (74) (C) AT-Pases como Rho y Mfd pueden eliminar el RNAP estancado del ADN (13, 25, 91) y (D ) la cotranscripción por dos polimerasas disminuye el retroceso de la CE principal (24, 47).

La cotranscripción por dos T7 RNAP estrechamente asociados también puede aumentar la transcripción a través de un nucleosoma (47). Se utilizó un ensayo de descompresión de ADN basado en pinzas ópticas y # x02013 para investigar cómo dos T7 RNAP colaboran para transcribir más allá de una barrera de nucleosoma (Figura 7). Al descomprimir el ADN dúplex, los autores mapearon directamente la posición del sitio activo de RNAP. Se usó electroforesis en gel del mensaje de ARN para determinar la longitud del transcrito con sensibilidad de un solo nucleótido. Una comparación de la posición del RNAP con la longitud de la transcripción del ARNm especificó hasta qué punto retrocedió el RNAP al encontrar una barrera de nucleosoma.

Dos ARN polimerasas (RNAP) colaboran para superar una barrera de nucleosomas. Se utilizó un ensayo basado en pinzas ópticas para mapear la posición de un sitio activo de T7 RNAP después de encontrar un nucleosoma. (a) Los RNAP individuales se estancan y retroceden en una barrera de nucleosomas. El ADN contenía un solo promotor T7 RNAP (azul) y un nucleosoma fuertemente posicionado (marrón). Al encontrar el nucleosoma, RNAP se estancó y retrocedió 75 pb lejos de la díada del nucleosoma. Casi no se observó transcripción completa después de una incubación de 10 s. (B) Se introdujo un RNAP final en un segundo promotor. El RNAP líder ya no retrocedió y se detuvo a 60 pb de la díada del nucleosoma. Una gran fracción de moléculas de RNAP pudo transcribir a través de la barrera del nucleosoma.

Las posiciones del RNAP de T7 retrocedido individual después de una ronda de transcripción de 10 s a través de un nucleosoma se muestran en la Figura 7.a . La electroforesis en gel del ARNm indicó que la transcripción se detuvo en la posición & # x0221260 pb con respecto a la díada del nucleosoma. Sin embargo, el RNAP retrocedió un & # x0221215 pb adicional del extremo 3 & # x02032-mRNA al encontrar un nucleosoma. Además, la transcripción de escorrentía a través de un nucleosoma se vio significativamente comprometida, incluso después de una reacción de transcripción de 30 minutos (47).

Una segunda EC de T7 RNAP estimuló significativamente la transcripción del RNAP principal a través de un nucleosoma. La construcción de ADN y la ubicación del sitio activo principal de RNAP para esta construcción se muestran en la Figura 7B . El sitio activo principal de RNAP se desplazó en + 15 pb, en relación con la construcción de T7 única que se muestra en la Figura 7a . Además, un RNAP final podría estimular la transcripción a través del nucleosoma cinco veces y reducir las pausas y el retroceso del RNAP principal. Sobre la base de estos hallazgos, los autores propusieron un modelo mediante el cual el RNAP posterior proporciona una fuerza de asistencia que rescata al RNAP líder retrocedido; la acción combinada de dos motores que actúan simultáneamente promueve la transcripción a través del nucleosoma (47).

Los resultados con dos RNAP de T7 codireccionales coincidieron firmemente con los estudios bioquímicos de ambos E. coli y transcripción de RNAP de levadura a través de un nucleosoma (24, 57). Una pol II final estimuló significativamente la lectura del nucleosoma por parte de la CE principal y tuvo una fuerte influencia en el destino del nucleosoma (57). Cuando los RNAP estaban cerca uno del otro, el nucleosoma se transfirió de manera eficiente detrás de la EC final. Cuando las polimerasas se dividieron en etapas más separadas, se perdió el nucleosoma. Los autores propusieron un modelo mediante el cual, si dos RNAP están cerca, el nucleosoma puede interactuar físicamente con la pol II final y transferirse detrás de ambas CE. Sin embargo, si hay espacio en el ADN entre las dos CE, entonces el primer RNAP deposita un hexasoma detrás de sí mismo, y este hexasoma se desplaza completamente del ADN al encontrarse con la polimerasa final.

En conjunto, estas observaciones están produciendo una imagen más general de cómo los RNAP pueden transcribir a través de barreras nucleosomales. Los RNAP de fagos de transcripción rápida y la pol III de levadura pueden alargarse más allá de un nucleosoma de manera eficiente, y la transcripción se modula en gran medida por el desenvolvimiento transitorio del nucleosoma. Por el contrario, el más lento E. coli El RNAP y la pol II eucariota hacen una pausa y retroceden en una barrera de nucleosoma, mientras que los mecanismos antibacktracking estimulan la progresión de la pol II más allá del nucleosoma.

La situación es más complicada en las células vivas y muchos factores adicionales de remodelación de la cromatina, como Asf1 y FACT, participan en la regulación de la transcripción en las plantillas cromatinizadas (98, 100). Las reconstituciones in vitro muestran que estas enzimas se asocian con RNAP II y ayudan en la transcripción de nucleosomas pasados. Los experimentos futuros de una sola molécula pueden ayudar a determinar el papel de estos y otros factores accesorios en la regulación de la transcripción a través de los nucleosomas.


Materiales y métodos SI

Cepas y métodos de cultivo.

Las cepas utilizadas en este trabajo se derivaron de EcM2.1 (mi. coli MG1655 mutS_mut dnaG_Q576A exoX_mut xonA_mut xseA_mut 1255700 :: tolQRA Δ (ybhB-bioAB) :: [λcI857 N (cro-ea59)::tetR-bla]) (33). El medio de cultivo líquido consistió en la formulación Lennox de caldo de lisogenia (LB L) [1% (p / vol) bacto triptona, 0,5% (p / vol) extracto de levadura, 0,5% (p / vol) cloruro de sodio] (46) con agentes selectivos apropiados: carbenicilina (50 μg / mL) y SDS [0,005% (p / vol)]. Para tolC En las contraselecciones, se utilizó colicina E1 (colE1) en una dilución 1: 100 de una purificación interna (47) que midió 14,4 μg de proteína / μL (22, 36) y vancomicina a 64 μg / mL. El medio de cultivo sólido consistió en LB L esterilizado en autoclave con 1,5% (peso / volumen) de Bacto Agar (Fisher) que contenía las mismas concentraciones de antibióticos necesarias. Las placas de agar ColE1 se generaron como se describió anteriormente (33). Los tiempos de duplicación se determinaron en un lector de microplacas BioTek Eon con agitación orbital a 365 ciclos por minuto a 34 ° C durante la noche y se analizaron utilizando un script Matlab disponible en GitHub (https://github.com/churchlab/agr_recoding).

Oligonucleótidos, PCR y ensamblaje isotérmico.

Se puede encontrar una tabla completa de oligonucleótidos MAGE y cebadores de PCR en Dataset S1.

Los productos de PCR utilizados en la recombinación o para la secuenciación de Sanger se amplificaron con polimerasa Kapa2G Fast de acuerdo con los protocolos estándar del fabricante. mascPCR se utilizó para el genotipado multiplexado de eventos de reemplazo de AGR utilizando el kit KAPA2G Fast Multiplex PCR, de acuerdo con métodos anteriores (22, 48). Las reacciones de secuenciación de Sanger fueron realizadas por un tercero (GENEWIZ). Los plásmidos CRAM se ensamblaron a partir de cadenas principales de plásmido linealizadas usando PCR (49) y secuencias CRISPR / PAM obtenidas en Gblocks de Integrated DNA Technologies, usando ensamblaje isotérmico a 50 ° C durante 60 min (50).

Recombinaciones de Lambda Red, MAGE y CoS-MAGE.

La recombinación de Lambda Red, MAGE y CoS-MAGE se llevaron a cabo como se describió anteriormente (33, 51). En las recombinaciones singleplex, el oligo MAGE se utilizó a 1 µM, el oligo de coselección fue de 0,2 µM y el conjunto de oligo total fue de 5 µM en las recombinaciones multiplex (7-14 oligos). Cuando se recombinaron productos de PCR de doble hebra (por ejemplo, inserción de tolC), se utilizaron 100 ng de producto de PCR de doble hebra. Porque usamos CoS-MAGE con tolC selección para reemplazar los codones AGR diana, cada recombinación se emparejó con un control recombinado con agua solo para monitorear tolC rendimiento de la selección. El protocolo estándar CoS-MAGE para cada conjunto de oligo fue insertar tolC, inactivar tolC, reactivar tolCy eliminar tolC. mascPCR se realizó en el tolC pasos de inserción, inactivación y eliminación. Todas las recombinaciones de Lambda Red fueron seguidas por una recuperación en 3 mL LB L seguida de una selección de SDS (tolC inserción, tolC activación) o contraselección ColE1 (tolC inactivación, tolC deleción) que se llevó a cabo como se describió anteriormente (33).

Estrategia general de reemplazo de AGR.

Los codones AGR en genes esenciales se encontraron cruzando la anotación de genes esenciales de acuerdo con dos recursos complementarios (31, 52) para encontrar el conjunto compartido (107 regiones codificantes), que contenía 123 codones AGR únicos (82 AGA, 41 AGG). Usamos optMAGE (35, 51) para diseñar oligos de 90 meros (dirigidos a la hebra rezagada de la bifurcación de replicación) que convierten cada AGR en CGU. Redujimos el número total de oligos de reemplazo de AGR a 119 diseñando oligos para codificar múltiples ediciones cuando fuera posible, manteniendo al menos 20 pb de homología en los extremos 5 'y 3' del oligo. Luego, los oligos se agruparon según la posición cromosómica en 12 conjuntos de oligos MAGE de complejidad variable (mínimo: 7, máximo: 14) de modo que un solo marcador (tolC) podría insertarse como máximo 564,622 pb en sentido ascendente en relación con la dirección de replicación para todos los objetivos dentro de un conjunto dado. Luego identificamos tolC sitios de inserción para cada uno de los 12 grupos en regiones intergénicas o genes no esenciales que cumplían los criterios de distancia para un grupo determinado. Consulte la Tabla 1 para obtener descriptores de cada uno de los 12 grupos de oligonucleótidos.

Estrategia de resolución de problemas.

Un AGR recalcitrante se definió como uno que no se convirtió en CGU en uno de al menos 96 clones seleccionados después del tercer paso del proceso de conversión. El codón AGR recalcitrante se clasificó luego para la resolución de problemas (asteriscos en la Fig.3A) en la cepa parental (EcM2.1). En primer lugar, se examinó el contexto de secuencia del codón en busca de errores de diseño o problemas potenciales, como una anotación errónea o un RBS alterado para un gen superpuesto. En la mayoría de los casos, los oligonucleótidos corregidos podrían diseñarse y probarse fácilmente. Si no era posible un rediseño tan obvio, intentamos reemplazar AGR con mutaciones CGN. Si al intentar reemplazar AGR con CGN no se obtienen recombinantes, probamos mutaciones sinónimas compensatorias en una ventana de 3-aa alrededor del AGR recalcitrante. Si es necesario, finalmente relajamos el rigor sinónimo mediante la recombinación con oligos que codifican mutaciones de AGR a NNN.

Después de cada paso en el flujo de trabajo de resolución de problemas, seleccionamos 96 clones de dos recombinaciones CoS-MAGE sucesivas utilizando PCR específica de alelo con cebadores que se hibridan con el genotipo de tipo salvaje. Las secuencias que no produjeron un amplicón de tipo salvaje se secuenciaron con Sanger para confirmar la conversión. También medimos el tiempo de duplicación de todos los clones en LB L para emparejar los datos de secuenciación con los datos de aptitud y elegimos el clon recombinado con el tiempo de duplicación más corto. El tiempo de duplicación se determinó mediante la obtención de una curva de crecimiento en un lector BioTek Eon o H1plate y se analizó utilizando un software de resecuenciación del genoma de código abierto basado en la web disponible en GitHub en https://github.com/churchlab/millstone. A continuación, este genotipo se implementó en la cepa completa al final de la construcción de la cepa usando MAGE y se confirmó mediante cribado mascPCR.

Codones AGR en genes no esenciales con impacto en genes esenciales.

En mi. coli MG1655, solo tres codones AGR en genes no esenciales se superponen con los motivos iniciales de ARNm y RBS de genes esenciales, y se predice que al menos un codón CGN sinónimo obedecerá a la SRZ para los tres casos. Como en el proceso de resolución de problemas, intentamos reemplazar los codones AGR con mutaciones CGT usando MAGE. Después de cuatro ciclos de MAGE, las células se sembraron en placas y se seleccionaron 96 clones. El reemplazo del codón sinónimo fue posible para los genes rffT y mraW, pero no para el gen yidD. Luego relajamos el rigor sinónimo mediante la recombinación con oligos que codifican mutaciones de AGR a NNN para el gen yidD y encontró múltiples soluciones alternativas que incluyen CGA, UGA, GUG, GCG y TAA. Es importante destacar que las soluciones alternativas sinónimas de CGA fueron menos disruptivas que la CGU para la fuerza de RBS y el plegamiento de ARNm (Dataset S7), lo que confirma aún más nuestras reglas como pautas útiles.

Cálculos de fuerza de RBS y plegamiento de ARNm.

Se utilizó una canalización personalizada de Python (disponible en https://github.com/churchlab/agr_recoding) para calcular el plegamiento de ARNm y el valor de fuerza de RBS para cada secuencia. El plegamiento del ARNm se basó en la calculadora UNAFold (40) y la fuerza de RBS se basó en la calculadora Salis (53). Los parámetros para el plegamiento del ARNm son la temperatura (37 ° C) y la ventana utilizada, que fue un promedio entre -30 a +100 nt y -15 a +100 nt alrededor del sitio de inicio del gen y se basó en la ref. 12. El único parámetro para la fuerza de RBS es la distancia entre el RBS y el promotor, y promediamos entre 9 y 10 nt después del codón de interés, basado en Li et al. (20). La visualización de datos se realizó a través de un código Matlab personalizado.

Para en silico predicciones en todo el genoma, todos los 3222 AGR en genes que no son fagos se analizaron utilizando esta canalización personalizada. Los datos se presentan en el conjunto de datos S7. Los genes de los fagos no se analizaron para reducir la complejidad del genoma, inspirado por otros esfuerzos reducidos del genoma (54).

Secuenciación del genoma completo de cepas que carecen de codones AGR en sus genes esenciales.

El ADN genómico cortado se obtuvo cortando 130 μL de ADN genómico purificado en un ultrasonicador focalizado Covaris E210. La preparación de la biblioteca de genoma completo se llevó a cabo como se describió anteriormente (55). Brevemente, 130 μL de ADN genómico purificado se cortaron durante la noche en un ultrasonicador Covaris E210 con el siguiente protocolo: ciclo de trabajo 10%, intensidad 5, 200 ciclos por ráfaga, tiempo 780 s por muestra. Se ensayó el cizallamiento de las muestras en un gel de agarosa y, si la distribución era aceptable (distribución de pico ∼400 nt), las muestras se seleccionaron por tamaño mediante purificación con SPRI / SPRI inverso como se describe en la ref. 55. A continuación, se hicieron romos los fragmentos y se ligaron los adaptadores p5 / p7, seguido de relleno y reparación de huecos (New England Biolabs). Cada muestra se cuantificó mediante qPCR utilizando SYBR green y Kapa Hifi. Estos resultados se usaron para determinar cuántos ciclos deberían usarse para amplificar la biblioteca resultante para códigos de barras usando cebadores P5-sol y P7-sol. Las bibliotecas individuales resultantes se cuantificaron mediante NanoDrop (Thermo Scientific) y se combinaron. La biblioteca resultante se cuantificó mediante qPCR y Agilent TapeStation y se ejecutó en MiSeq 2 × 150. Los datos se analizaron para confirmar las conversiones de AGR e identificar mutaciones fuera del objetivo utilizando Millstone, una herramienta de resecuenciación del genoma de código abierto basada en la web.

Secuenciación NNN y CRISPR.

Se utilizó CRISPR / Cas9 para reducir el genotipo parental de tipo salvaje cortando selectivamente los cromosomas en los sitios diana no modificados junto a los cambios de codones AGR deseados. Los sitios candidatos se determinaron utilizando el buscador de sitios diana incorporado en Geneious proximalmente cerca del codón AGR al que se dirige. Los sitios se eligieron si estaban a menos de 50 pb corriente arriba del codón AGR y podían interrumpirse con cambios sinónimos. Si varios sitios cumplían estos criterios, se eligió el sitio con el nivel más bajo de similitud de secuencia con otras porciones del genoma. Se diseñaron oligonucleótidos de una longitud de ~ 130 pb para los 14 genes con un codón AGR en los primeros 30 nt después del sitio de inicio de la traducción. Esos oligos incorporaron tanto un codón aleatorio NNN en la posición AGR como múltiples (hasta seis) cambios sinónimos en un sitio diana CRISPR al menos 50 nt cadena abajo de un codón AGR. Este cambio modifica el locus AGR y al mismo tiempo interrumpe el sitio objetivo CRISPR, asegurando la aleatorización del locus después de que se elimine el genotipo parental.

Específicamente, construimos un plásmido que contiene el gen de la proteína SpCas9 [detalles del plásmido: DS-SPcas (plásmido Addgene 48645): origen cloDF13, specR, promotor proC, SPcas9, tracrRNA sin usar (con promotor y terminador nativos), promotor J23100, una repetición ( añadido para facilitar la clonación en un espaciador sobre el mismo plásmido)]. También construimos 14 plásmidos que contienen el ARN guía dirigido hacia las secuencias no modificadas (detalles del plásmido: PM-! T4Y: origen p15a, cloro R, promotor J23100, espaciador dirigido a T4, una repetición).

Para cada uno de los 24 genes, se realizaron cinco ciclos de MAGE con el oligo de mutagénesis específico a una concentración de 1 µM. Los plásmidos espaciadores de repetición CRISPR que llevan guías diseñadas para apuntar a los sitios elegidos se electroporaron en cada grupo diversificado después del último ciclo de recombinación. Después de 1 h de recuperación, tanto el plásmido SpCas9 como el espaciador de repetición se seleccionaron y se pasaron en tres linajes paralelos para cada uno de los 24 codones AGR durante 144 h. Después de 2 h de selección, y en cada intervalo de 24 h, se tomaron muestras y las células se diluyeron 1/100 en medio selectivo.

Cada población aleatorizada se amplificó utilizando cebadores de PCR que permiten la amplificación específica de cepas que incorporan las modificaciones del sitio CRISPR. Las bibliotecas por triplicado resultantes para cada codón AGR se agruparon y codificaron con barras con cebadores P5-sol y P7-sol y se ejecutaron en un MiSeq 1 × 50. Los datos se analizaron utilizando el código Matlab personalizado disponible en https://github.com/churchlab/ agr_recoding.

Para cada gen y cada punto de datos, las lecturas se alinearon con el genoma de referencia y se calcularon las frecuencias de cada codón. En la Fig. 5, la desviación de la estructura del ARNm (línea roja) y la desviación de la fuerza de RBS (línea azul) en unidades arbitrarias se calcularon como el producto de las frecuencias y la desviación correspondiente para cada codón.


Resumen y direcciones futuras

Una lección que surge de los estudios de knockout sistémico es que las mutaciones con pérdida de función por sí solas son insuficientes para deducir las funciones de los genes. Si se necesitan enfoques genéticos adicionales, ¿a dónde debemos dirigirnos? Es difícil argumentar con éxito, y los estudios de sobreexpresión ciertamente tienen una rica historia en el establecimiento de vínculos funcionales para esencialmente cualquier proceso celular en varias especies. Como se resume aquí, los estudios de sobreexpresión brindan varias ventajas: (1) es una herramienta versátil que se puede aplicar de varias maneras en entornos de tipo salvaje y mutante (2) puede identificar pasos reguladores que limitan la velocidad (3) tiene efectos dominantes , por lo que se puede realizar fácilmente en organismos diploides (4) proporciona enlaces funcionales incluso para genes redundantes e (5) identifica interacciones complementarias de pantallas de pérdida de función.

Por otro lado, al menos dos barreras han obstaculizado el uso más amplio de la sobreexpresión. La sobreexpresión dirigida de un gen individual se puede realizar en prácticamente cualquier organismo, pero las limitaciones técnicas y la falta de recursos apropiados han inhibido las pantallas de sobreexpresión rutinarias en todo el genoma. Las limitaciones biológicas, como la incapacidad de mantener el ADN introducido como plásmidos, permanecerán en algunas especies, pero la falta de recursos no es un desafío insuperable. Una barrera que es más difícil de evaluar es la opinión mal informada de que es difícil obtener conocimientos biológicos significativos cuando los genes se expresan a niveles no fisiológicos. Ningún método experimental está exento de advertencias, pero las preocupaciones de estudiar un fenotipo de sobreexpresión no son diferentes de las asociadas con cualquier otro mutante. Las células de fondo se alteran independientemente de si una vía se interrumpe por un knockout, por una mutación de ganancia de función dominante. , o por sobreexpresión. Aunque los efectos neomórficos potencialmente confusos siguen siendo una posibilidad, la experiencia y los resultados de las primeras pantallas sistemáticas a gran escala (Sopko et al. 2006) sugieren que son poco frecuentes y abrumadoramente equilibrados por los abundantes beneficios proporcionados. Más importante aún, los ejemplos proporcionados aquí son simplemente la punta del iceberg, demostrando que cuando se usa apropiadamente con criterios de cribado secundarios razonables, la sobreexpresión puede ser tan efectiva, informativa y tan versátil como cualquier otra técnica de cribado.

Paralelamente a las tendencias que ocurren en otras áreas de la genética, los estudios de sobreexpresión han entrado en una nueva fase. Aunque la sobreexpresión dirigida de genes individuales proporciona información valiosa, y las pantallas aleatorias seguirán siendo una herramienta poderosa con distintas ventajas, es probable que los enfoques sistemáticos para consultar el genoma dominen la próxima década. Se han realizado cribados sistemáticos piloto en levaduras, moscas, plantas y sistemas de cultivo de tejidos humanos utilizando recursos de sobreexpresión grandes pero incompletos. Un desafío para el futuro será la finalización de las colecciones de recursos y el desarrollo de tecnologías de detección de alto rendimiento para facilitar su uso. Sobre la base de los estudios de detección de sobreexpresión sistemáticos iniciales en levadura, podemos esperar que las redes de interacción de sobreexpresión contribuyan con nuevos vínculos genéticos a medida que los resultados se incorporan con otros grandes conjuntos de datos, como las interacciones físicas y los resultados de la recopilación de deleciones.


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Materiales y métodos

Secuenciación, ensamblaje y anotación del genoma

Las cepas cuya secuencia de genoma aún no estaba disponible se secuenciaron utilizando varias plataformas de extremo emparejado de Illumina (archivo complementario 1). La calidad de las lecturas de secuenciación resultantes se verificó utilizando FastQC versión 0.11.3, y los adaptadores de secuenciación contaminantes se eliminaron utilizando seq_crumbs versión 0.1.9. Las lecturas se ensamblaron con Spades (Bankevich et al., 2012) versión 3.5.0, utilizando diferentes tamaños de k-mer según la longitud de las lecturas y con la opción "cuidadoso" para reducir los errores de ensamblaje, se excluyeron los contigs por debajo de 200 pares de bases. Los contigs ensamblados resultantes se anotaron para codificar genes, ARN ribosomales y ARNt utilizando Prokka (Seemann, 2014) versión 1.11. Cepas que no pertenecen al E. coli Las especies fueron excluidas del análisis posterior después de ser destacadas por Kraken (Wood y Salzberg, 2014) versión 0.10.5. Cuando estaba disponible, la información de tipificación se utilizó para detectar secuencias genómicas incorrectas debido a contaminaciones de cultivos u otros factores. La tipificación de cepas conocidas se comparó con las predichas a partir de la secuencia del genoma utilizando mlst versión 2.8. Los nombres de las cepas se modificaron cuando fue posible (consulte la columna "Notas" en el archivo complementario 1). La colección ECOR fue cuidadosamente revisada para detectar inconsistencias, ya que es bien sabido que diferentes "versiones" de esta colección están circulando en la comunidad científica (Johnson et al., 2001 Clermont et al., 2015). Las secuencias del genoma se verificaron adicionalmente en busca de genomas duplicados: se marcaron cepas con genomas muy similares pero fenotipos muy divergentes (correlación de puntuación S de fenotipos por debajo de 0,6) y se eliminó el genoma que pertenecía a la cepa más probablemente incorrecta. Si el conflicto no se pudo resolver (es decir, utilizando información de tipificación conocida), se eliminaron ambos genomas. Los genomas muy similares se definieron como aquellos genomas cuya distancia se encontró por debajo de 0,001, medida por mash (Ondov et al., 2016), versión 1.1. A pesar del estado preliminar de los genomas presentado en este estudio, observamos un tamaño del genoma central similar al calculado utilizando un conjunto de 376 E. coli genomas descargados de RefSeq de NCBI (datos no mostrados).

Llamadas y anotaciones SNP

Debido a la variabilidad en las tecnologías de secuenciación o la falta de lecturas originales para las cepas ya secuenciadas en la colección (N = 373), los SNP se llamaron a través de una alineación del genoma completo entre cada cepa y el genoma del individuo de referencia (Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655, acceso RefSeq: NC_000913.3, identificador de colección de cepas NT12001), usando ParSNP (Treangen et al., 2014) versión 1.2. Las regiones repetidas en el genoma de referencia se destacaron y enmascararon mediante nucmer (Kurtz et al., 2004) versión 3.1 y Bedtools (Quinlan y Hall, 2010) versión 2.26.0. Luego, los SNP se modificaron por fases y se anotaron utilizando SnpEff (Cingolani et al., 2012) versión 4.1g.

Análisis de pangenoma

Los genes presentes en el individuo de referencia pero ausentes en cada cepa se destacaron calculando el grupo ortólogo jerárquico utilizando OMA (Altenhoff et al., 2013) versión 1.0.6. Cada cepa se volvió a anotar previamente utilizando Prokka (Seemann, 2014) versión 1.11 para armonizar las llamadas de genes.

Filogenética

El árbol filogenético de las cepas se calculó utilizando un único análisis ParSNP (Treangen et al., 2014), que genera una alineación de nucleótidos del genoma completo en todas las cepas, que luego se utiliza como entrada para FastTree (Price et al., 2010) versión 2.1. 7. El árbol se visualizó utilizando la biblioteca ete3 (Huerta-Cepas et al., 2016a) versión 3.0.0.

Las distancias filogenéticas entre pares de cepas se han calculado utilizando contrastes filogenéticos independientes, a fin de tener en cuenta las interdependencias filogenéticas entre cepas (Felsenstein, 1985). En resumen, primero hemos restringido los datos fenotípicos a aquellas cepas y condiciones con menos del 10% de datos faltantes y luego imputamos el resto usando el puntaje S promedio para cada cepa, usando la biblioteca scikit-learn (Pedregosa et al., 2011 ) versión 0.17.1. Para cada condición, calculamos los contrastes independientes filogenéticos a través de los nodos internos del árbol de las cepas, utilizando las bibliotecas de simios, geiger y fitool (Paradis et al., 2004 Harmon et al., 2008 Revell, 2012), versiones 5.0, 2.0 0,6 y 0,6-20, respectivamente. A continuación, se calculó la distancia fenotípica entre los nodos utilizando la distancia euclidiana entre los contrastes filogenéticos independientes en todas las condiciones, utilizando la biblioteca nadista versión 0.1.0.

Cálculo de todas las posibles mutaciones y su efecto.

El impacto de todas las posibles sustituciones no sinónimas en el individuo de referencia se ha calculado previamente para acelerar el proceso de búsqueda. El impacto funcional de las sustituciones no sinónimas se ha calculado utilizando SIFT (Ng y Henikoff, 2001) versión 5.1.1, utilizando uniref50 como base de datos de búsqueda de secuencias. El impacto estructural de las sustituciones no sinónimas se ha calculado usando FoldX (Guerois et al., 2002) versión 4, se usaron tanto las estructuras 3-D presentes en la base de datos PDB como los modelos de homología. Los modelos de homología se crearon utilizando ModPipe (Pieper et al., 2014) versión 2.2.0. La conversión de coordenadas de residuos PDB a Uniprot se derivó de la base de datos SIFTS (Velankar et al., 2013).Las estructuras PDB se "repararon" para corregir los ángulos de torsión de los residuos y los choques de Van der Waals antes de calcular el impacto de las variantes no sinónimas en la estabilidad estructural. Todos los impactos precalculados de todas las posibles sustituciones no sinónimas están disponibles a través de la base de datos mutfunc (http://mutfunc.com).

Cálculo de la puntuación de interrupción

Para cada cepa y cada proteína codificante de genes, hemos calculado el impacto general de todas las sustituciones no sinónimas y sin sentido, en un enfoque similar al utilizado para Saccharomyces cerevisiae (Jelier et al., 2011). La salida de cada predictor (una probabilidad deletérea para SIFT y un valor de ΔΔG para FoldX) se ha convertido a la probabilidad de que la sustitución sea neutra p (n e u t r a l). Las mutaciones con impacto conocido en el individuo de referencia se descargaron de Uniprot (UniProt Consortium, 2015, N = 3673) y se utilizaron para derivar dicha conversión, ya que solo se informa que 580 mutaciones tienen un impacto neutral, agregamos todas las variantes no sinónimas observadas que afectan a elementos esenciales conocidos. genes (como se informa en la base de datos OGEE, Chen et al., 2017) a la lista de mutaciones toleradas. La distribución del logaritmo natural negativo de la probabilidad de SIFT (más un pseudo recuento equivalente a la probabilidad de SIFT más baja observada) para todas las 6460 mutaciones se clasificó y la p (neutral) se calculó como la proporción de mutaciones toleradas sobre el número total de mutaciones. en cada contenedor. Luego se ajustó una curva de regresión logística a la distribución agrupada para derivar la conversión entre la probabilidad de SIFT y p (n e u t r a l). Para FoldX usamos un enfoque similar, pero usando el valor ΔΔG calculado. Las curvas de regresión logística ajustadas dieron como resultado las siguientes funciones P (n e u t r a l):

El valor P (neutro) atribuido a mutaciones sin sentido se asignó mediante heurísticas: si el nuevo codón de parada se encontraba dentro de los últimos 16 residuos de la proteína, se le dio un valor P (neutro) de 0,99, lo que refleja su improbabilidad de interrumpir la función de la proteína, 0,01 en caso contrario. La pérdida de un codón de inicio o de terminación recibió un valor de P (n e u t r a l) de 0,01, ya que es muy probable que alteren la función de las proteínas.

Dimos un valor de P (n e u t r a l) de 0,01 a aquellos genes que se encontraron presentes en el individuo de referencia pero ausentes en la cepa objetivo, lo que refleja el hecho de que es más probable que su función esté ausente de la cepa objetivo.

Inferimos la probabilidad de que cada gen tuviera su función afectada por el conjunto de sustituciones en cada cepa calculando una puntuación de disrupción, equivalente a la P (A F) (probabilidad de que la función se vea afectada) utilizada en S. cerevisiae estudio (Jelier et al., 2011).

Dónde k es el conjunto de sustituciones no sinónimas y sin sentido observadas en cada gen. Cuando las predicciones FoldX y SIFT estaban disponibles para una sustitución determinada, usamos solo la predicción SIFT. No se consideraron las variantes con una frecuencia relativamente alta (& gt = 10%) en la colección de cepas, así como aquellos genes de referencia que están ausentes en un número significativo de cepas (& gt = 10%), ya que razonamos que es poco probable que sean perjudicial dada su alta frecuencia observada. Dado que muchas cepas de la colección están estrechamente relacionadas (por ejemplo, cepas derivadas de la colección LTEE), las agrupamos en función de la distancia filogenética antes de aplicar el filtrado. Tampoco consideramos variantes y genes de referencia ausentes compartidos por todos los miembros de la colección de cepas LTEE, ya que esas variantes están presentes en la cepa fundadora de la colección y, por lo tanto, es poco probable que afecten a los fenotipos de clones evolucionados. Las puntuaciones de disrupción para todas las proteínas en todas las cepas se pueden encontrar en el archivo complementario 5.

Uso de la puntuación de disrupción como predictor de asociación funcional

Usamos la correlación de pares de proteínas de Pearson de puntajes de disrupción como un predictor de asociaciones funcionales de genes. Usamos cuatro conjuntos de evaluación comparativa: operones, derivados de la base de datos DOOR (Mao et al., 2014), complejos de proteínas y rutas derivadas de la base de datos EcoCyc (Keseler et al., 2013), e interacciones proteína-proteína derivadas de una reciente experimento de levadura de dos híbridos (Rajagopala et al., 2014). La distribución de la correlación de la puntuación de disrupción para cada par de genes relacionados se comparó con el mismo número de pares de genes extraídos aleatoriamente de todos los genes de referencia. También evaluamos el poder predictivo de las correlaciones de puntajes de interrupción dibujando una curva de características del operador receptor (ROC) a través de cada umbral de correlación, utilizando la biblioteca scikit-learn (Pedregosa et al., 2011) versión 0.17.1.

Fenotipado de cepas

Los fenotipos de las cepas se midieron de forma similar a la E. coli cribado genético inverso (Nichols et al., 2011). La colección de cepas se sembró en tres placas de agar sólido, cada una con 1536 colonias individuales, de modo que cada cepa se sembró al menos cuatro veces en cada placa, cada vez con diferentes cepas vecinas. Para cada condición, preparamos tres réplicas (cada una con una placa fuente diferente para reducir los efectos del lote) con las concentraciones indicadas en el archivo complementario 2 y la adición del colorante Cosmos (número CAS 573-58-0) y azul brillante Coomasie R- 250 (número CAS 6104-59-2). La solución tiñe las colonias cuando se desarrolla la biopelícula. Las placas se almacenaron en la oscuridad a temperatura ambiente, a menos que la condición específica (es decir, temperatura más alta) requiriera lo contrario, y se tomaron fotografías de las placas hasta que se encontró que las colonias crecían en exceso entre sí. La mayoría de las condiciones (N = 197) se probaron al mismo tiempo y en las mismas condiciones de laboratorio que la colección KEIO KO (Herrera-Dominguez et al., Inédito).

De cada fotografía se extrajeron una serie de parámetros de colonia, utilizando Iris (Kritikos et al., 2017) versión 0.9.4.71: tamaño de colonia, opacidad, redondez e intensidad del color. El momento más apropiado para cada condición se determinó imponiendo una restricción al tamaño medio de la colonia entre 1900 y 3600 píxeles para las dos primeras placas, y entre 1300 y 3600 para la última placa, que contenía las cepas derivadas de experimentos de evolución, que tienden a crecer menos que los aislamientos naturales. Los puntos de tiempo que pasan el primer umbral se ordenaron luego por la proporción de colonias con alta redondez (& gt0.8), que es indicativa de la calidad general de la placa, la proporción de colonias por encima del umbral de tamaño medio mínimo de colonia, la propagación de la distribución del tamaño de la colonia (cuanto menor, mejor) y correlación del tamaño medio de la colonia entre las réplicas.

Se tomaron una serie de medidas de control de calidad adicionales sobre los parámetros de la colonia. Con el fin de eliminar los defectos de fijación sistemáticos, se eliminaron las colonias que parecían faltantes (tamaño de colonia de cero píxeles) en más del 66% de las placas probadas, a menos que se encontrara que faltaban todas las réplicas internas. Se eliminaron las colonias con circularidad anormal, ya que se debían principalmente a un reconocimiento incorrecto de colonias por parte del software: se eliminaron las colonias con un tamaño inferior a 1000 píxeles y circularidad inferior a 0,5 y las colonias con un tamaño superior a 1000 píxeles y circularidad inferior a 0,3. Las contaminaciones putativas se detectaron y eliminaron mediante un enfoque de navaja de variación: primero, se corrigió el tamaño de las colonias de dos filas y columnas más externas para que coincidiera con la mediana del resto de la placa, luego, para cada cepa, cada una de las cuatro réplicas dentro de la placa se probó si contribuía a más del 90% de la variación total del tamaño de la colonia. Si es así, la réplica se marcó como contaminación y se eliminó. Se repitió el mismo enfoque utilizando circularidad de colonias, con un umbral de varianza del 95%.

Los tamaños finales de las colonias se utilizaron como entrada para el algoritmo EMAP (Collins et al., 2006), con parámetros predeterminados, con el fin de derivar un puntaje S, que informa sobre la desviación de cada cepa del crecimiento esperado en cada condición. . Los puntajes S finales se normalizaron por cuantiles y los fenotipos significativos se destacaron utilizando una corrección de FDR del 5% similar a la utilizada en el E. coli cribado genético inverso (Nichols et al., 2011), utilizando la biblioteca statsmodels versión 0.6.1. Los datos fenotípicos están disponibles en el archivo complementario 4.

Cálculo de la puntuación condicional y su evaluación

Se derivaron genes condicionalmente esenciales para cada condición del E. coli El cribado genético inverso se superpone con las condiciones probadas en la colección de aislamientos naturales. Se consideró que los mutantes con un fenotipo de crecimiento significativo derivaban la lista de genes condicionalmente esenciales. La puntuación condicional para cada cepa, que indica la predicción de crecimiento, se calculó de la siguiente manera:

Dónde s y C representan la tensión y la condición, respectivamente, gramo cada gen condicionalmente esencial para la condición C (con tamaño l), y E s que representa un término de corrección para la puntuación de interrupción, con el fin de eliminar el efecto de la distancia filogenética (Figura 2 - Figura 1).

Dónde norte representa todos los genes de referencia. El término W g, c se utiliza para ponderar la contribución de cada gen condicionalmente esencial a la puntuación condicional, y se calcula de la siguiente manera:

Donde F g, c es el valor p corregido por FDR del gen gramo en condicion C, C g es el número de condiciones en la pantalla de genómica química donde el gen gramo muestra un fenotipo significativo y N c el número total de condiciones probadas en la pantalla de genómica química.

La puntuación condicional se evaluó calculando una curva Precision-Recall, cuya área (PR-AUC) se utilizó como medida directa del poder predictivo del método, los fenotipos de crecimiento se consideraron verdaderos positivos. La curva PR y su AUC se calcularon utilizando la biblioteca scikit-learn (Pedregosa et al., 2011) versión 0.17.1. Se utilizaron tres enfoques de aleatorización para generar puntuaciones condicionales de control: uno que utiliza la mezcla de cepas, otro que utiliza la mezcla de conjuntos de genes condicionalmente esenciales y otro que utiliza conjuntos de genes condicionalmente esenciales al azar. Cada estrategia de aleatorización se ha utilizado para generar 10.000 puntuaciones aleatorias, que se escalaron a la real antes de la evaluación.

Los conjuntos de genes condicionalmente esenciales, la puntuación condicional y los valores PR-AUC están disponibles en el archivo complementario 5.

Asociación de genes accesorios con fenotipos

Los genes accesorios del pangenoma de la colección de cepas se calcularon a partir de las anotaciones genómicas armonizadas realizadas por Prokka (Seemann, 2014), utilizando la versión 3.6.1 de Roary (Page et al., 2015). Los genes accesorios se asociaron a los fenotipos de cada condición utilizando Scoary (Brynildsrud et al., 2016) versión 1.4.0, con parámetros predeterminados. Los genes con valor de p corregido (Benjamini-Hochberg) de asociación por debajo de 0,05 se consideraron significativos. El enriquecimiento de genes condicionalmente esenciales entre los genes de referencia significativos se evaluó mediante una prueba exacta de Fisher, tal como se implementó en la biblioteca SciPy, versión 0.17.0.

Complementación sistemática in-silico de genes condicionalmente esenciales

El potencial para restaurar los fenotipos de crecimiento a través de la introducción de alelos de referencia se predijo sistemáticamente en cada cepa cambiando la puntuación de disrupción a cero en cada gen condicionalmente esencial e informando el cambio en la puntuación condicional: con respecto a la puntuación condicional máxima posible:

Donde P m a x (A F) es la puntuación máxima de disrupción observada en todos los genes y cepas. Cualquier Δ S s, c superior al 1% de S s, c m a x se consideró potencialmente capaz de restaurar un fenotipo de crecimiento.

Complementación experimental de genes causantes de fenotipo predichos

Para verificar experimentalmente nuestras predicciones, introdujimos el gen de referencia (BW25113) en un plásmido de baja copia. Para el slt gen, utilizamos el plásmido disponible de la biblioteca TransBac (H. Dose y H. Mori, recurso no publicado, Otsuka et al., 2015). Para acrA, acrB y glnD, utilizamos el plásmido disponible de la biblioteca de plásmidos móviles (Saka et al., 2005). Nosotros amplificamos un cangrejo, soxSR, proAB de BW25113 y ligado en pNTR-SD (el plásmido de la cadena principal para la biblioteca de plásmidos móviles). Eliminaciones de un cangrejo, soxSR, proAB en la cepa de referencia se realizaron utilizando el método de recombinación con rojo lambda (Datsenko y Wanner, 2000). Los siete plásmidos resultantes y los dos controles de plásmido vacíos se introdujeron en BW25113 (control negativo), en las cepas de deleción de la colección Keio o construidas por nosotros (control positivo) y en las cepas diana. Todas las cepas resultantes se fijaron utilizando un robot Singer Rotor en 10 condiciones diferentes, en dos placas de agar sólido, de modo que cada cepa se fijó al menos cuatro veces por placa. Las placas se incubaron a temperatura ambiente y se tomaron múltiples fotografías hasta que se encontró que las colonias crecían en exceso entre sí. Se utilizó la versión 0.9.7 de Iris (Kritikos et al., 2017) para extraer el tamaño de la colonia de las imágenes.

Disponibilidad de recopilación de códigos, datos y cepas

Se han depositado nuevas secuencias genómicas en el European Nucleotide Archive (ENA) con el número de acceso PRJEB20550.


Ver el vídeo: Escherichia coli pathogenesis (Diciembre 2022).