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¿La tasa metabólica determina qué tan rápido se acortan los telómeros?

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En muchos artículos se puede leer que los telómeros pueden jugar un papel importante en la longevidad. Según Calado et al.1 los telómeros de los ratones son mucho más largos que los telómeros de los humanos. Sin embargo, los ratones tienen una esperanza de vida media de unos 2 años y los humanos unos 80 años.

Por tanto, ¿determina la tasa metabólica qué tan rápido se acortan los telómeros? ¿Se puede decir que cuanto mayor es la tasa metabólica, más rápido se acortan los telómeros?

  1. Dinámica de los telómeros en ratones y humanos

Acortamiento y supervivencia de los telómeros en córvidos de vida libre

Se acumula evidencia de que el acortamiento de los telómeros refleja el estilo de vida y predice la esperanza de vida restante, pero se sabe poco sobre la dinámica de los telómeros y su relación con la supervivencia en condiciones naturales. Presentamos datos de telómeros longitudinales en grajillas de vida libre (Corvus monedula) y probar hipótesis sobre el acortamiento y la supervivencia de los telómeros. Los telómeros en los eritrocitos se midieron usando electroforesis en gel de campo pulsado. Las tasas de acortamiento de los telómeros dentro de los individuos fueron dos veces más altas que la pendiente del nivel de la población, lo que demuestra que los individuos con telómeros cortos tienen menos probabilidades de sobrevivir. Un análisis más detallado mostró que la tasa de acortamiento, en particular, predijo la supervivencia, porque el acortamiento de los telómeros se aceleró mucho durante el último año de un ave en la colonia. El acortamiento de los telómeros también fue más rápido al principio de la vida, incluso después de que se completó el crecimiento. Anteriormente se demostró que las longitudes de los telómeros más cortos predicen mejor la senescencia celular, lo que sugiere que los telómeros más cortos deberían estar mejor protegidos. Probamos la última hipótesis y mostramos que, dentro de los individuos, los telómeros largos se acortan más rápido que los telómeros cortos en adultos y polluelos, un resultado que no se había mostrado previamente. en vivo. Además, la selección de supervivencia en adultos fue más notoria en telómeros relativamente largos. En conclusión, nuestros datos longitudinales indican que la tasa de acortamiento de los telómeros largos puede ser una medida del & # x02018estres de la vida & # x02019 y, por lo tanto, es prometedora como un biomarcador de la vida útil restante.


Abstracto

Muchos organismos son capaces de crecer más rápido que ellos. La tasa de crecimiento restringida se ha explicado funcionalmente por los efectos negativos sobre la vida útil del crecimiento acelerado. Sin embargo, los mecanismos subyacentes siguen siendo esquivos. La atrición de los telómeros se ha propuesto como un agente causal y se ha estudiado principalmente en vertebrados endotérmicos. Establecimos que los telómeros existen como extremos cromosómicos en un insecto modelo, el grillo de campo. Gryllus campestris, usando el fragmento de restricción terminal y Bal 31 métodos. Los telómeros comprendían repeticiones de TTAGGn de 38 kb en promedio, más de cuatro veces más que los telómeros de los bebés humanos. Bal 31 los ensayos confirmaron que las repeticiones teloméricas estaban ubicadas en los extremos de los cromosomas. Probamos si el crecimiento rápido entre el día 1, el día 65, el día 85 y el día 125 se logra a expensas de la longitud de los telómeros comparando ninfas criadas a 23 ° C con sus hermanos criados a 28 ° C, que crecieron tres veces más rápido en el 65 días iniciales. Sorprendentemente, ni el tratamiento con la temperatura ni la edad afectaron la longitud promedio de los telómeros. Al mismo tiempo, la heredabilidad en sentido amplio de la longitud de los telómeros fue notablemente alta en

100%. A pesar de la alta heredabilidad, la capacidad de evolución (una medida estandarizada media de la varianza genética) fue baja en relación con la de la masa corporal. Discutimos nuestros hallazgos en el contexto de la evolución de los telómeros. Algunas características importantes de la biología de los telómeros de los vertebrados son evidentes en una especie de insecto que se remonta al Triásico. La aparente falta de un efecto de la tasa de crecimiento sobre la longitud de los telómeros es desconcertante, lo que sugiere un fuerte mantenimiento de la longitud de los telómeros durante la fase de crecimiento. Si tal mantenimiento de la longitud de los telómeros es adaptativo sigue siendo difícil de alcanzar y requiere más estudios para investigar los vínculos con la aptitud en la naturaleza.


1. INTRODUCCIÓN

Se cree que la variación en las historias de vida es el resultado de la asignación diferencial de recursos limitados a los rasgos de la historia de vida en competencia. Tales compensaciones y la asignación óptima de recursos resultante pueden variar con las condiciones ambientales (Stearns, 1992). Por ejemplo, los ambientes tropicales han favorecido un ritmo de vida lento, es decir, una fecundidad reducida pero una mayor esperanza de vida, en muchos vertebrados (Ricklefs y Wikelski, 2002). Esto está especialmente bien estudiado en aves donde las especies tropicales producen menos crías, pero de mayor calidad (Jetz, Sekercioglu y Böhning-Gaese, 2008 Martin, 2015), tienen tasas metabólicas basales más bajas (Tieleman et al., 2009 Wiersma, Muñoz-García , Walker y Williams, 2007) y viven más tiempo (Møller, 2007 Peach, Hanmer y Oatley, 2001) que las especies templadas. Por lo tanto, una comparación entre especies tropicales y templadas puede revelar limitaciones fisiológicas que pueden limitar la evolución de combinaciones alternativas de rasgos de historia de vida (Ricklefs y Wikelski, 2002).

Un mecanismo candidato importante con respecto a las limitaciones fisiológicas del crecimiento, la reproducción y la supervivencia son los telómeros (Haussmann & Marchetto, 2010). Los telómeros son ADN no codificantes: tapas proteicas al final de los cromosomas eucariotas que protegen la integridad genómica, pero se acortan durante la división celular y potencialmente cuando se exponen al estrés oxidativo (Boonekamp, ​​Bauch, Mulder y Verhulst, 2017 Reichert y Stier, 2017 Zglinicki, 2002) . Críticamente, los telómeros cortos eventualmente conducen a la senescencia o muerte celular (Blackburn, 2000, 2005), y la acumulación de células con telómeros cortos puede ser uno de los factores que causa envejecimiento y senescencia en vertebrados (López-Otín, Blasco, Partridge, Serrano). Y Kroemer, 2013).

Tanto los estudios longitudinales como los transversales en aves muestran que, en general, los individuos mayores tienen telómeros más cortos que los más jóvenes, y la mayor pérdida de telómeros ocurre temprano en la vida (Heidinger et al., 2012 Pauliny, Larsson y Blomqvist, 2012 Salomons et al., 2009 Spurgin et al., 2018 Tricola et al., 2018). Además, un número cada vez mayor de estudios en aves muestra que los individuos con telómeros más largos o poca atrición de telómeros tienen mejores perspectivas de supervivencia que los individuos con telómeros cortos o altos niveles de atrición de telómeros (revisado en Wilbourn et al., 2018). Esto ha sido especialmente estudiado en pinzones cebra (Taeniopygia guttata), por lo que se ha demostrado que los telómeros largos en la vida temprana se asocian con una mayor supervivencia y una vida útil más larga (Heidinger et al., 2012). Además, los estudios en una variedad de especies muestran que la dinámica de los telómeros es sensible a las influencias ambientales, como las variaciones en la disponibilidad de alimentos (Spurgin et al., 2018), las enfermedades parasitarias (Asghar et al., 2015) y la exposición al estrés (Hau et al., 2015). En particular, las condiciones experimentadas durante el desarrollo pueden influir en la dinámica de los telómeros. Por ejemplo, la exposición a ambientes pobres o estresantes puede conducir a una pérdida acelerada de telómeros en aves jóvenes (Costanzo et al., 2017 Haussmann, Longenecker, Marchetto, Juliano y Bowden, 2012 Herborn et al., 2014 Nettle et al., 2017 Salmon , Nilsson, Nord, Bensch e Isaksson, 2016 Soler et al., 2017 Young et al., 2017), que puede predecir una disminución de la supervivencia como polluelos o polluelos (Boonekamp, ​​Mulder, Salomons, Dijkstra y Verhulst, 2014 Salmon , Nilsson, Watson, Bensch e Isaksson, 2017 Watson, Bolton y Monaghan, 2015). Por lo tanto, la longitud de los telómeros y la tasa de pérdida de telómeros se consideran biomarcadores de la salud y la calidad individuales (Young, 2018).

Menos estudios han comparado la longitud de los telómeros entre taxones que varían en sus historias de vida y su esperanza de vida. En los mamíferos, un estudio comparativo encontró que las especies pequeñas de vida corta tienen telómeros más largos y una expresión de telomerasa más alta que las especies grandes de vida larga (Gomes et al., 2011). En un estudio sobre roedores, no se detectó relación entre la vida útil máxima y la longitud de los telómeros (Seluanov et al., 2007). En las aves, la longitud absoluta de los telómeros no parece relacionarse con la variación en la esperanza de vida entre las especies; sin embargo, las especies aviares de vida más larga parecen tener tasas más bajas de acortamiento de los telómeros que las especies de vida más corta (Dantzer & Fletcher, 2015 Haussmann et al., 2003 Sudyka , Arct, Drobniak, Gustafsson y Cichoan, 2016 Tricola et al., 2018). Esta relación entre la tasa de pérdida de telómeros y la vida útil máxima de las aves puede deberse a la variación entre especies en el mantenimiento de los telómeros a lo largo de su vida útil. Además, puede reflejar la desaparición selectiva de individuos de baja calidad con telómeros cortos. En especies de vida más larga, que experimentan niveles más bajos de mortalidad extrínseca, la condición individual y, por lo tanto, la dinámica de los telómeros, pueden desempeñar un papel más importante como determinantes de la mortalidad (Kirkwood y Austad, 2000). Por lo tanto, la desaparición selectiva de individuos con telómeros cortos puede ser más evidente en especies longevas (Tricola et al., 2018).

Las especies tropicales viven en ambientes menos estacionales con niveles más bajos de mortalidad extrínseca de adultos que los templados (Brown, 2014). En consecuencia, las aves cantoras tropicales tienen mayores probabilidades de supervivencia que las aves de zonas templadas (Martin et al., 2017 Muñoz, Kéry, Martins y Ferraz, 2018). Por lo tanto, se espera una desaparición selectiva más fuerte de individuos con telómeros cortos en aves tropicales en comparación con aves templadas. Sin embargo, las tasas de mortalidad dependen de la edad y, por lo tanto, la fuerza de la desaparición selectiva puede variar con la edad. En las aves, la mortalidad suele ser más alta durante el primer año de vida, especialmente directamente después de emplumar (Cox, Thompson, Cox y Faaborg, 2014 Naef-Daenzer y Grüebler, 2016). Como predice la teoría del ciclo de vida (McNamara, Barta, Wikelski y Houston, 2008), la supervivencia de los juveniles es en general más alta en las aves tropicales en comparación con las templadas (Lloyd, Martin y Roskaft, 2016 Remes y Matysiokova, 2016). Los padres tropicales cuidan a sus menos polluelos durante mucho más tiempo que las aves de zonas templadas y, por lo tanto, pueden reducir la mortalidad extrínseca de los juveniles (Styrsky, Brawn y Robinson, 2005). Por lo tanto, planteamos la hipótesis de que la supervivencia diferencial de los polluelos de alta calidad debería ser más evidente en las aves tropicales que en las templadas. Suponiendo que los telómeros son bioindicadores del estado somático y la calidad individual, esperamos que en las aves tropicales, los individuos con telómeros cortos desaparezcan más rápidamente de una población que en las aves templadas, tanto durante el crítico primer año de vida como luego como adultos.

Además, existe buena evidencia de que las especies tropicales invierten más en el auto mantenimiento, pero son menos fecundas que las especies templadas. Por ejemplo, las especies tropicales exhiben un comportamiento de enfermedad más fuerte después de la infección durante la temporada de reproducción que las especies templadas (Owen-Ashley, Hasselquist, Raberg y Wingfield, 2008). Además, en las especies tropicales, la carga de trabajo reproductivo se reduce a medida que ponen nidadas más pequeñas, por lo que cuidan a menos crías y gastan menos energía que las aves de zonas templadas (Nilsson, 2002 Tieleman et al., 2006). Por lo tanto, pueden reducir los altos niveles de estrés oxidativo (Noguera, 2017) y la posible pérdida de telómeros asociada con la reproducción (Reichert et al., 2014). Además, los pájaros cantores tropicales parecen tener tasas metabólicas posnatales más bajas y un crecimiento más lento y sostenido a pesar de tiempos de anidación similares a los de las aves de zonas templadas (Martin, 2015 Ton & Martin, 2016). Estas trayectorias de crecimiento más lento en combinación con un mayor cuidado de los padres por descendencia pueden favorecer niveles más bajos de desgaste de los telómeros durante la vida temprana en las aves tropicales, que a su vez pueden ser determinantes importantes de su esperanza de vida más larga (Monaghan y Ozanne, 2018). Por lo tanto, se espera que las especies tropicales de vida más larga, que invierten más en crecimiento y autosuficiencia que en fecundidad, muestren telómeros más largos como polluelos o una tasa más lenta de pérdida de telómeros que las especies templadas de vida corta. Para determinar cómo la variación del ciclo de vida ha dado forma a la variación en los telómeros, es necesario realizar comparaciones entre la misma especie o especies estrechamente relacionadas en diferentes entornos.

Recolectamos muestras de machos de piedra afrotropical (denominados tropicales) y templados europeos (denominados templados) de diferentes individuos en cuatro clases de edad: como polluelos, como aves de primer año antes de la reproducción (dentro de sus primeros 6 meses de vida). , durante su primera temporada de cría (

1 año de edad) y durante su vida adulta (≥2 años). Debido a su lento ritmo de vida, se espera que los stonechats tropicales den prioridad al mantenimiento somático sobre la fecundidad. Por lo tanto, esperábamos telómeros más largos en las zonas tropicales en comparación con las charlas de piedra de las zonas templadas. Además, debido a su mayor supervivencia juvenil y al cuidado parental extendido, esperábamos una disminución menor en la longitud de los telómeros durante el primer año de vida en las zonas tropicales en comparación con las zonas templadas.


2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Organismo de estudio

9 meses de edad) dragones hembras (Ctenophorus pictus, W. Peters, 1866) fueron capturados con una soga o con la mano en la Reserva Natural de Yathong, Nueva Gales del Sur, Australia (145 ° 35'E 32 ° 35'S) y llevados a las instalaciones de la Universidad de Sydney en octubre de 2015, donde se alojaron durante la duración de los experimentos. Los animales se recolectaron con un permiso emitido por el Servicio de Vida Silvestre y Parques Nacionales de Nueva Gales del Sur (SL100352), y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con la aprobación de ética de la Universidad de Sydney (AEC-2013/6050). Las hembras se alojaron en parejas en tinas de plástico opaco (330 × 520 × 360 mm) con sustrato arenoso y se expusieron a un ciclo de 12 horas de luz: 12 horas de oscuridad. Los lagartos fueron alimentados con gusanos de la harina y grillos, espolvoreados con calcio y multivitamínicos, hasta saciarlos todos los días, y las jaulas se rociaron con agua una vez al día. Se proporcionaron lámparas de calor y pieles cerámicas para permitir que las lagartijas se regularan térmicamente a su temperatura corporal preferida (36 ° C M.O., datos no publicados obtenidos de lecturas de temperatura cloacal en la naturaleza). Se disponía de un montículo de arena húmeda en cada tina para permitir que las hembras excavaran y pusieran huevos. Se comprobó la oviposición de las hembras todos los días, como se aprecia en los colgajos de piel alrededor del abdomen. En total, 18 hembras produjeron 22 nidadas y 89 huevos en total entre el 4 de noviembre de 2015 y el 6 de enero de 2016. Los huevos se extrajeron y se pesaron con una precisión de 0,1 g. Como parte de una investigación sobre los efectos de la temperatura en la TL, los huevos individuales de cada nidada se colocaron secuencialmente en una de las cuatro incubadoras (27, 30, 32, 36 ° C, ± 0,5 ° C) para separar los efectos de la nidada y la temperatura. . Los huevos se enterraron a medias en una mezcla 1: 7 de agua a vermiculita en recipientes sellados y transparentes en cada incubadora. Los contenedores se sellaron para reducir la evaporación del agua, pero se airearon semanalmente. Los huevos se revisaron diariamente en busca de huevos no viables, que fueron retirados. Setenta y tres dragones eclosionaron y se retiraron 16 huevos no viables (la mayoría de la incubadora a 36 ° C, que es más cálida que la temperatura de incubación estimada en la naturaleza: aproximadamente 30 ° C, M.O., datos no publicados). Las crías se sexaron (determinado por la presencia o ausencia de hemipenos), se pesaron con una precisión de 0,1 gy se midieron la longitud hocico-respiradero (SVL) y la longitud total con una precisión de mm. Cada individuo se marcó con un patrón de pinza de dedo único para su identificación. Luego, los individuos se colocaron en grupos en tinas con las mismas condiciones que las hembras adultas, con la excepción del montículo de arena. Las crías de dragones fueron alimentadas con grillos cabeza de alfiler, espolvoreados con calcio y multivitaminas, hasta la saciedad todos los días. La mortalidad es alta en los dragones pintados juveniles, pero las tinas se revisaron varias veces al día y los individuos muertos se retiraron de inmediato.

2.2 Recolección de muestras

En marzo de 2016, los 24 juveniles restantes (14 hembras, 10 machos, con edades comprendidas entre 97 y 140 días, 1 hembra y 3 machos incubados a 27 ° C, 6 hembras y 5 machos incubados a 30 ° C, 5 hembras y 2 machos incubados a 32 ° C, 2 hembras incubadas a 36 ° C) se sacrificaron por decapitación. Antes de la decapitación, los individuos se sedaron primero enfriándolos en un refrigerador durante 10 minutos y en un congelador durante 2 minutos. Se sexaron nuevamente para confirmar asignaciones previas, se pesaron con una precisión de 0,1 gy se midió la LES y la longitud total con una precisión de mm. A continuación, se recogieron sangre completa, cerebro completo, corazón, hígado y bazo. Cada tipo de tejido se colocó en 300 µl de RNAlater (Sigma-Aldrich, Castle Hill, NSW, Australia) y se almacenó a -80 ° C hasta la extracción del ADN.

2.3 Cuantificación de la longitud relativa de los telómeros

Para analizar la longitud relativa de los telómeros (RTL en relación con el gen 18S), primero purificamos el ADN de los tejidos recolectados. El cerebro, el corazón y el hígado se cortaron en trozos pequeños y se utilizaron 50 µl de sangre diluida en la extracción. Se utilizó un kit DNeasy Blood and Tissue (Qiagen, Chadstone, VIC, Australia) para las extracciones, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La etapa de digestión de la proteína quinasa se ejecutó durante 10 minutos para la sangre, pero el cerebro, el corazón, el hígado y el bazo requirieron incubación durante la noche para una digestión completa. Se añadió RNasa A (Qiagen, Chadstone, VIC, Australia) a la concentración recomendada. La concentración de ADN (ng / µl) y la proporción A260: A280 de cada muestra se midieron por duplicado usando un Nanodrop (Thermo Fisher Scientific) y las alícuotas se diluyeron a 10 ng / µl usando el tampón AE proporcionado en el kit de extracción de ADN. Solo las muestras con una relación A260: A280 entre 1,7 y 1,9 y una concentración superior a 10 ng / µl se consideraron de calidad suficientemente alta para ser utilizadas en los análisis. En última instancia, 22 sangre (12 mujeres, 10 hombres), 18 hígado (9 mujeres, 9 hombres), 17 corazones (8 mujeres, 9 hombres), 16 cerebros (11 mujeres, 5 hombres) y 10 bazos (6 mujeres, 4 macho) las muestras eran de calidad suficiente para su uso en el estudio. El ADN se almacenó a -30 ° C.

La longitud de los telómeros se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando el kit SensiMix SYBR No-ROX (Bioline, Sydney, NSW, Australia) y un termociclador Rotor-gene 6000 (Qiagen, Chadstone, VIC, Australia) de acuerdo con los protocolos publicados ( Rollings, Friesen, et al., 2017 Rollings, Uhrig, et al., 2017) utilizando técnicas desarrolladas por Criscuolo et al. (2009) y Plot, Criscuolo, Zahn y Georges (2012) con el gen del ARN ribosómico 18S (18S) como el gen de referencia del número de copia no variable. Los cebadores de telómeros utilizados fueron Telb1 (5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3 ′) y Telb2 (5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTTACCCTTACCCTTACCCT-3 ′, 2002).

El gen 18S (amplicón de 92 pb en Anolis) fue seleccionado como gen de referencia ya que había sido previamente validado en reptiles (Plot et al., 2012 Rollings, Uhrig, et al., 2017). Las secuencias de cebadores utilizadas fueron 18S-F (5′-GAGGTGAAATTCTTGGACCGG-3 ′) y 18S-R (5′-CGAACCTCCGACTTTCGTTCT-3 ′). Las reacciones se ejecutaron por triplicado para cada muestra, y cada ejecución contenía cebadores Telb o 18S.Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Australia) utilizando un paso de activación Taq inicial a 95 ° C durante 10 min y un total de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 15 s, y 72 ° C durante 15 s. Cada reacción tuvo un volumen final de 20 µl con 10 ng de ADN, cebadores directos e inversos usados ​​a una concentración de 250 nM y MgCl2 añadido para una concentración de 1,7 mM. Se añadieron 11,25 µl de la mezcla maestra SensiMix SYBR No-ROX por reacción. Se generó una curva de fusión después de cada corrida en el rango de temperatura de 60 a 95 ° C para asegurar que no hubiera amplificación de producto inespecífico (ver el apéndice Figura S1 y Figura S2 para ejemplos). Todas las muestras de ADN de un individuo determinado se incluyeron en la misma serie. Las reacciones de control sin molde se realizaron por triplicado para cada conjunto de cebadores durante cada ejecución de qPCR para garantizar que no hubiera contaminación. Se produjeron curvas estándar, usando el ADN combinado de tres lagartos seleccionados al azar, tanto para telómeros como para 18S usando diluciones seriadas cuádruples para asegurar tasas consistentes de amplificación en un amplio rango de concentraciones (60 ng / µl hasta 0.05859 ng / µl con 6 diferentes concentraciones en total: Figura S3 del Apéndice y Figura S4) que dan un rango dinámico lineal de 0,05859 a 60 ng / µl. La reacción se consideró consistente cuando el coeficiente de correlación lineal excedió 0,985. La eficiencia de la amplificación de los telómeros fue de 1,17 y la eficiencia de la amplificación de 18S fue de 0,97, y todas las muestras cayeron dentro del mismo rango de concentración que nuestros estándares. Todos los experimentos incluyeron el mismo "estándar de oro" y también un control sin plantilla para detectar la contaminación. LinRegPCR 2016.0 (Heart Failure Research Center, Ruijter et al., 2009, Tuomi, Voorbraak, Jones y Ruijter, 2010) se utilizó para analizar los datos de qPCR. Las concentraciones iniciales de telómero (T) y gen de control (S 18S) determinadas con LinRegPCR se utilizaron para determinar la longitud relativa de los telómeros con el cálculo T / S. Los telómeros y el gen de control se evaluaron en experimentos separados. El coeficiente medio de variación interensayo para qPCR se ejecuta para telómeros (norte = 4) y 18S (norte = 4) la amplificación fueron 2,98% y 0,59%, respectivamente, calculados utilizando el estándar de oro. El coeficiente de variación intraensayo para las pruebas de telómero y 18S fue de 1,09% y 0,90%, respectivamente. Un modelo lineal general no encontró diferencias significativas en la distribución de los sexos entre las placas (F1,23 = 1.211, pag = 0,283). Para investigar los posibles efectos de la ejecución, tomamos el valor medio de cada triplicado según lo producido por LinRegPCR para los datos de sangre para simplificar el análisis. Un ANOVA de los datos de 18S transformados en ln (para normalidad) no mostró diferencias significativas entre las ejecuciones (F3,18 = 0.795, pag = 0.513) y tampoco las ejecuciones que contienen telb (F3,18 = 0.888, pag & lt 0,466).

2.4 Análisis estadísticos

Los análisis se realizaron con SAS 9.4 (SAS Institute, Cary) y SPSS 25.0 (IBM, Armonk). RTL se transformó en N para ajustarse a la normalidad, como se verificó con una prueba de Shapiro-Wilk. Los efectos potenciales de la condición corporal (BCI) se evaluaron generando los residuos de un análisis de regresión de masa versus SVL al momento de la muerte. Primero, para probar si la incubación a diferentes temperaturas había afectado los resultados, se realizó un análisis de modelo mixto de la relación entre el RTL y la temperatura de incubación, con la identificación individual y la identificación materna como factores aleatorios, y se encontró que no era significativa (F1,15.1 = 0.17, pag = 0.6818, norte = 78). Para investigar más a fondo los efectos potenciales de la temperatura de incubación, se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson de temperatura, tiempo de incubación y masa de eclosión. Las correlaciones de Pearson se realizaron entre RTL y SVL en la eclosión y muerte, masa en la eclosión y muerte, BCI residual en la muerte, edad en la muerte y tasa de crecimiento (calculada como la diferencia entre la eclosión y la muerte SVL, dividida por la edad). También se calcularon los coeficientes de correlación de Pearson para los telómeros de todas las combinaciones de los tipos de tejido para probar la similitud en la dinámica de los telómeros a través de los tejidos. Elegimos no aplicar una corrección (por ejemplo, Bonferroni) a este análisis a pesar del número de correlaciones probadas, ya que los tamaños de muestra bajos disponibles limitan nuestro poder estadístico y aumentan la probabilidad de errores de tipo II. La aplicación de una corrección solo aumentaría aún más la posibilidad de errores de tipo II y reduciría nuestra probabilidad de detectar efectos reales (Nakagawa, 2004). Para probar los efectos de los telómeros específicos del sexo y del órgano, se probó un análisis de modelo mixto de la relación entre el RTL y el sexo, el tipo de órgano y una interacción sexo x tipo de órgano con ID incluido para controlar múltiples medidas del mismo individuo. La interacción sexo × tipo de órgano no fue significativa (F4,73 = 1.206, pag = 0,316), pero se retuvo en el modelo final ya que resultó en una probabilidad de registro de -2 Res menor. A medida que se detectaron los efectos del tipo de órgano, se realizaron contrastes por pares entre cada tipo de órgano. Se realizaron ajustes secuenciales de Bonferroni para todos los contrastes por pares. Como se encontraron diferencias basadas en el sexo en el RTL, se realizaron GLM que probaron las diferencias basadas en el sexo en el SVL al momento de la eclosión y muerte, masa al momento de la eclosión y muerte, BCI residual al momento de la muerte, edad y tasa de crecimiento para determinar si las diferencias de tamaño podrían explicar el problema. variación en RTL.


La tasa de pérdida de telómeros está relacionada con la vida útil máxima de las aves.

Los telómeros son regiones de ADN altamente conservadas que protegen los extremos de los cromosomas lineales. La pérdida de telómeros puede indicar un cambio irreversible en el estado de una célula, incluida la senescencia celular. Las células senescentes ya no se dividen y pueden dañar las células sanas cercanas, colocándolas potencialmente en la encrucijada del cáncer y el envejecimiento. Si bien la epidemiología, la biología celular y molecular de los telómeros están bien estudiadas, está surgiendo un campo más nuevo que explora la biología de los telómeros en el contexto de la ecología y la evolución. Con el trabajo hasta la fecha centrado en cómo el acortamiento de los telómeros se relaciona con la mortalidad individual, se sabe menos sobre cómo los telómeros se relacionan con las tasas de envejecimiento entre las especies. Aquí, investigamos la longitud de los telómeros en muestras transversales de 19 especies de aves para determinar cómo las tasas de pérdida de telómeros se relacionan con la variación interespecífica en la vida útil máxima. Descubrimos que las especies de aves con una esperanza de vida más larga pierden menos repeticiones teloméricas cada año en comparación con las especies con una esperanza de vida más corta. Además, el análisis filogenético reveló que la tasa de pérdida de telómeros se conserva evolutivamente dentro de las familias de aves. Esto sugiere que las causas fisiológicas del acortamiento de los telómeros, o la capacidad de mantener los telómeros, son características que pueden ser responsables de, o co-evolucionar con, diferentes períodos de vida observados en las especies.

Este artículo es parte del tema "Comprender la diversidad en la dinámica de los telómeros".

1. Introducción

Con el avance de la edad, los organismos experimentan un deterioro funcional gradual que conduce a una disminución del rendimiento y un aumento del riesgo de mortalidad. Si bien el envejecimiento, o senescencia, es una ocurrencia común en todos los grupos taxonómicos, el patrón y el ritmo del proceso de envejecimiento son variables tanto dentro como entre las especies [1]. La comprensión de los procesos que subyacen a esta variación sigue siendo una cuestión central en diversos campos de la biología. Dentro de la biología evolutiva, una mejor comprensión de los fundamentos del proceso de envejecimiento puede, en última instancia, dar una idea de las compensaciones de la historia de vida y la evolución de la esperanza de vida [2].

Un factor que contribuye al fenotipo de envejecimiento es la senescencia celular [3, 4]. Este proceso provoca un cambio irreversible en el estado de una célula, en el que la célula deja de dividirse y sufre alteraciones fenotípicas distintivas, incluido un perfil secretor alterado que puede dañar las células sanas cercanas [3,5]. Debido a que el número de células senescentes aumenta durante el proceso de envejecimiento, hay una pérdida creciente de la capacidad regenerativa de las células con la edad [6]. La senescencia celular se produce como una respuesta compleja a un estrés extracelular o intracelular excesivo, que incluye, entre otros, daño severo del ADN, deterioro mitocondrial, estrés oxidativo y disfunción de los telómeros [5]. La erosión progresiva de los telómeros, las secuencias de ADN no codificantes al final de los cromosomas eucariotas lineales, finalmente desencadena una respuesta permanente al daño del ADN que hace que las células entren en senescencia [7]. Si bien el acortamiento de los telómeros es sólo uno de los factores que contribuyen a la senescencia celular, se ha convertido en un biomarcador de las células senescentes [8] y del estado fisiológico de un organismo [9,10].

La estructura de los telómeros es generalmente consistente en todos los eucariotas, lo que sugiere que los telómeros son un guardián antiguo y eficaz del genoma [11]. De acuerdo con esto, los telómeros juegan un papel amplio en el mantenimiento de la estabilidad genómica cromosómica. Normalmente, el extremo del telómero se pliega sobre sí mismo para formar una estructura denominada "T-loop" y, junto con las proteínas asociadas, cubre de manera efectiva los extremos de los cromosomas. Sin embargo, a medida que las células se replican, sus telómeros se acortan debido a restricciones de replicación de la ADN polimerasa en los extremos de los cromosomas [12]. El acortamiento de los telómeros durante la replicación del ADN también puede propagarse por roturas monocatenarias en las regiones teloméricas debido al estrés oxidativo [13]. Este acortamiento progresivo de los telómeros finalmente expondrá un extremo cromosómico libre descubierto que conduce a la detención permanente del ciclo celular [14]. La disfunción de los telómeros, entonces, aumenta el conjunto cada vez mayor de células senescentes y, por lo tanto, podría contribuir a la disminución de la función e integridad de los tejidos que es un sello distintivo del envejecimiento [15].

Los vínculos entre la pérdida de telómeros y la senescencia celular sugieren un papel importante del acortamiento de los telómeros en la disminución de la función fisiológica relacionada con la edad. En apoyo de esto, varios estudios en humanos han encontrado que las personas con telómeros más cortos también tienen una esperanza de vida reducida [16-19], aunque otros estudios no informan esta relación [18,20,21], y ver [22] para una discusión sobre el papel causal del acortamiento de los telómeros en el envejecimiento. Un análisis dentro de la pareja particularmente interesante de gemelos suecos informó que el gemelo con la longitud de los telómeros más corta también tenía una tasa de mortalidad que era tres veces mayor que su co-gemelo [19]. En consecuencia, un número creciente de estudios no humanos en poblaciones naturales, particularmente en aves silvestres, también muestra que las perspectivas de supervivencia están relacionadas con la longitud de los telómeros [23-30]. Y un informe notable sobre los pinzones cebra sugiere que la longitud de los telómeros en la vida temprana (a los 25 días de edad) es un predictor muy fuerte de la longevidad [30].

Si bien el número de estudios que exploran los vínculos entre la longitud de los telómeros y la supervivencia dentro de las especies continúa creciendo, ha habido relativamente pocos estudios comparativos que exploren cómo la biología de los telómeros se asocia con las tasas de envejecimiento o la esperanza de vida entre las especies. Los estudios comparativos proporcionan una herramienta poderosa para explorar la evolución del envejecimiento de los vertebrados en la naturaleza, ya que estos estudios aprovechan la gran cantidad de variación en la esperanza de vida entre las especies generada por la selección a largo plazo en diferentes entornos. En particular, las aves son un modelo especialmente atractivo para los estudios comparativos del envejecimiento, ya que se controlan convenientemente mediante el anillamiento y presentan una amplia variación de los rasgos del ciclo de vida [31].

El trabajo comparativo ha revelado que, si bien la longitud absoluta de los telómeros no parece relacionarse con la longevidad entre las especies ([32-35], pero ver [11]), la velocidad a la que los telómeros se acortan puede ofrecer una mejor comprensión de la evolución de la vida útil de un especie [35]. El primer estudio, realizado hace casi 15 años, encontró que las tasas específicas de degradación de los telómeros de las especies predicen la esperanza de vida máxima entre cinco especies de aves y ocho especies de mamíferos [35]. Hasta donde sabemos, desde ese momento sólo dos estudios adicionales han explorado esta cuestión, y ambos apoyaron el hallazgo original, lo que sugiere que la variación en las tasas de degradación de los telómeros entre las especies es indicativa de distintos niveles de mantenimiento de los telómeros [36,37]. Estos estudios lograron algunos avances en el diseño y análisis experimental, ya que Dantzer y Fletcher [36] aumentaron el número de especies estudiadas mientras se controlaba la filogenia, y Sudyka et al. [37] se centró en conjuntos de datos longitudinales. Sin embargo, ambos estudios también se basaron en datos preexistentes que fueron generados por una variedad de técnicas para medir la longitud de los telómeros e incluso dentro de un método, diferentes laboratorios pueden producir resultados muy diferentes [38,39]. Además, muchos de estos estudios aplican el método relativo de qPCR de medición de telómeros. Si bien esta técnica ofrece mediciones de telómeros rápidas y comparables dentro de un estudio, no es apropiada para comparaciones cuantitativas de la longitud de los telómeros entre laboratorios o especies [39]. Alternativamente, el ensayo de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) requiere más tiempo, pero proporciona una longitud absoluta de los telómeros basada en un marcador molecular físico que produce resultados más conmensurables entre las especies [39]. Los estudios basados ​​en datos que se generaron utilizando la misma metodología y análisis de medición de telómeros mientras se controla la filogenia son todavía muy necesarios [9,40].

(i) Nuestra principal hipótesis fue que las tasas de pérdida de telómeros están asociadas con la vida útil máxima de las especies, de modo que aquellas especies con tasas más lentas de erosión de los telómeros también tienen una vida útil máxima más larga [35]. Debido a la naturaleza comparativa de este estudio, los patrones de longitud y edad de los telómeros en una población o especie también pueden ser causados ​​por la desaparición selectiva de individuos con telómeros cortos [41] y también discutimos esto.

(ii) Un estudio comparativo reciente que utilizó análisis filogenéticos de más de 60 especies de mamíferos informó que la longitud media de los telómeros de una especie se correlaciona inversamente con la esperanza de vida [11]. Hasta donde sabemos, esta relación aún no se ha probado en un estudio de aves controlado filogenéticamente.

(iii) La hipótesis del borde telomérico [42] postula un papel causal del acortamiento de los telómeros en la formación de la longevidad. Si los telómeros críticamente cortos aumentan el riesgo de mortalidad, entonces un corolario de esta hipótesis es que las especies con longitudes medias de telómeros más cortas y tasas de pérdida de telómeros más rápidas también deberían tener una esperanza de vida más corta, lo que probamos aquí.

(iv) Otra hipótesis reciente en la biología de los telómeros es que los telómeros largos se acortan más rápidamente que los telómeros cortos, posiblemente porque los telómeros más largos son más sensibles a los eventos de daño de los telómeros [26]. Hasta donde sabemos, esta hipótesis solo se ha evaluado dentro de las especies, y probamos si existe algún apoyo entre las especies de aves.

2. Métodos

(una especie

Exploramos el acortamiento de los telómeros en muestras de sangre transversales de 19 especies de aves que representan 5 órdenes (tabla 1 y figura 1). Elegimos especies en las que se disponía de poblaciones de estudio a largo plazo, lo que nos permitió muestrear individuos en un amplio rango de su esperanza de vida máxima prevista (tabla 1). Las estimaciones de vida útil máxima para estas especies oscilan entre 7 y 50 años, y se basaron en poblaciones de estudios naturales a largo plazo. El sexo era desconocido para un número sustancial de individuos en muchas de las especies y, por lo tanto, el sexo no se incluyó en el análisis. Reconocemos que un posible sesgo en nuestros resultados puede deberse a diferencias sexuales en la mortalidad, ya que los hombres y las mujeres a menudo difieren en la mortalidad y la esperanza de vida [48] y las tasas de desgaste de los telómeros también pueden diferir según el sexo [49]. Debido a que se desconocía el sexo, en nuestros análisis se utilizó la esperanza de vida máxima promedio entre hombres y mujeres. Si bien puede haber algún error en las estimaciones de vida útil máxima, no creemos que sea suficiente para cambiar nuestras conclusiones. Aunque algunos estudios han sugerido que la esperanza de vida media o media puede reflejar las diferencias en el proceso de envejecimiento con mayor precisión, estos valores no estaban disponibles para todas las especies. Además, las estimaciones de la vida útil máxima nos permitieron ser coherentes con estudios anteriores [35-37].

Figura 1. Longitud de los telómeros (de sangre total medida por análisis TRF) en función de la edad en 19 especies de aves incluidas en el análisis comparativo. Las líneas son regresiones lineales y la pendiente de la línea de regresión para la longitud de los telómeros frente a la edad se utilizó como la tasa de cambio de los telómeros (TROC). La pendiente de la regresión, su error estándar y la r 2 están impresos dentro del panel de cada especie.

Tabla 1. Estimaciones transversales de la tasa de cambio de los telómeros de las células sanguíneas (TROC) de 19 especies de aves estudiadas (incluido el orden y la familia), la vida útil máxima observada (con referencias bibliográficas) y la masa corporal. El tamaño de la muestra (número de individuos) se incluye para cada especie junto con el rango de edades muestreado. * Comunicación personal de D.W.W., 2011.

(b) Métodos de laboratorio

Todas las muestras analizadas en este estudio se midieron utilizando el ensayo TRF siguiendo la metodología establecida previamente [26,50,51]. El ensayo TRF se desarrolló hace más de 25 años y todavía se utiliza ampliamente para validar otras técnicas de medición de telómeros [39]. El ensayo utiliza la digestión con enzimas de restricción de ADN genómico seguida de hibridación Southern con una sonda radiactiva que contiene una repetición terminal para medir la longitud media de los telómeros a partir de una distribución de TRF. El ensayo TRF tradicional tiene algunas desventajas, entre ellas que, junto con las repeticiones teloméricas terminales, también mide los telómeros intersticiales y está sesgado en contra de la detección de telómeros cortos. Una variante de esto, el ensayo de TRF en gel que usamos aquí, resuelve ambos problemas al sondear solo el saliente de la hebra G corta [39,52]. Es importante señalar que las mediciones de telómeros para 17 de las 19 especies se midieron en un solo laboratorio (M.F.H.), mientras que las dos especies restantes (Haematopus ostralegus y Parus mayor) se midieron con una metodología coherente adoptada del laboratorio antes mencionado. La eliminación de estas dos especies del análisis no cambia ninguno de los siguientes resultados. Además de la coherencia dentro de la técnica TRF, se sabe que los métodos de muestreo y almacenamiento de sangre y la extracción de ADN influyen en las estimaciones de la longitud de los telómeros [39]. A la luz de esto, usamos protocolos consistentes de almacenamiento y extracción, y si se hicieron pequeños cambios, pudimos validar que, dentro de este conjunto de muestra, no influyó en la medición de los telómeros. Para conocer la metodología específica sobre el ensayo de TRF en gel utilizado en este estudio, consulte Haussmann et al. [51].

(c) Análisis de la longitud de los telómeros

Se obtuvieron imágenes de geles de las 17 especies en una pantalla de fósforo con un generador de imágenes de modo variable Typhoon (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido) para visualizar los telómeros. La cantidad de señal radiactiva (densidad óptica, DO) en cada carril se corresponde con la cantidad de telómero en esa posición en el gel (i), y se cuantificó por densitometría en ImageJ (v. 1.51). La señal de fondo de la unión no específica de la sonda radiactiva se restó de todas las medidas de DO.Los marcadores moleculares específicos en cada gel diferían porque las condiciones del gel se optimizaron en función de la distribución de telómeros particular de una especie (1 kb de escalera de ADN (1 a 10 kb) 1 kb más escalera de ADN (1 a 12 kb) Lambda ADN / EcoR1 + HindIII ( 1–21 kb) Escalera de extensión de ADN de 1 kb (1–4 0 kb), Invitrogen λ DNA Monocut (2-49 kb) New England Biolabs DNA Marker XV (2-49 kb), Roche PFG Marker 1 (15-200 kb), New England Biolabs). Sin embargo, independientemente del marcador molecular utilizado, la distancia que cada banda del marcador molecular migró (i) se representó frente al peso molecular en kilobases y se convirtió en pesos moleculares (L) utilizando una función log-lineal de tres parámetros. La longitud media de TRF (denominada en adelante longitud media de los telómeros para simplificar) para cada individuo se calculó usando: media TRF = ∑ (ODi * LI) / ∑ (ODi), donde ODi es la salida de densitometría en la posición i, y Li es la longitud del ADN (kB) en la posición I [52].

(d) Análisis estadístico

Para cada especie, estimamos la tasa de cambio de los telómeros específicos de la especie (TROC, pb año -1) como la pendiente de la línea de regresión lineal para la longitud de los telómeros frente a la edad [35]. Hicimos esto porque, si bien tratamos de muestrear lo más ampliamente posible en el rango de edad para cada especie (tabla 1), estábamos limitados a lo que estaba disponible. Por lo tanto, hicimos una suposición heurística de una tasa lineal de pérdida de telómeros en todas las edades, ya que permitió estimaciones de TROC no sesgadas debido a las diferencias en el rango de la vida útil de las especies muestreadas. Si bien los estudios longitudinales informan que la tasa de pérdida de telómeros es más rápida en los primeros años de vida [40], es interesante que no observamos desviaciones claras de esta suposición (figura 1), pero a medida que se dispone de más datos comparativos de telómeros para la longitud de los telómeros (TL), las relaciones no lineales deberían ser explorado. Las diferencias entre la longitud media de los telómeros de las especies y el TROC se evaluaron en un modelo lineal. Las relaciones entre la longitud de los telómeros o TROC con la vida útil máxima entre las especies se evaluaron mediante un análisis comparativo.

En el análisis comparativo, la ascendencia compartida viola el supuesto de independencia entre los puntos de datos, y la inclusión de información filogenética explica estadísticamente dicha dependencia. Con este fin, se analizaron regresiones corregidas filogenéticamente utilizando mínimos cuadrados generalizados asumiendo una estructura de correlación browniana en el paquete mono en R [53]. La filogenia que usamos se extrajo de un supertárbol de aves [54]. El árbol más parsimonioso se seleccionó de una distribución bayesiana de 1000 árboles utilizando BEAST [55]. Por tanto, nuestros modelos no incorporan incertidumbre filogenética [56]. La señal filogenética, la cantidad de variación entre especies explicada por la ascendencia compartida [57], tanto en TROC como en la TL media se analizó en fitooles [58]. Ambos Pagel λ y K de Blomberg (con sólo K presentado, ya que ambos arrojaron resultados similares [59]). La evolución de los rasgos se trazó en la filogenia en fitooles [58] en R.

Nuestra hipótesis principal se centró en si TROC y cómo se asocia con la vida útil máxima entre especies (hipótesis i). Sin embargo, también exploramos si la longitud media de los telómeros está asociada con la vida útil máxima entre especies, como es el caso de los mamíferos (hipótesis ii [11]). Con este fin, ajustamos varios modelos en torno a estos predictores y también incluimos la masa corporal como una covariable [60]. Masa corporal (log10-transformado) se incluyó debido a las claras asociaciones entre masa corporal y longevidad [61]. La longitud media de los telómeros y la TROC fueron log10-transformado previo al análisis. La longitud de los telómeros aumentó con la edad en dos especies (H. ostralegus y Oceanodroma leucorhoa), lo que da como resultado un TROC negativo y, por lo tanto, los valores de TROC fueron log10 (X + 100) -transformado. La inclusión o eliminación de estas covariables nos permitió investigar cualquier sensibilidad de nuestros resultados para significar la longitud de los telómeros y la masa corporal, pero los resultados fueron similares en todos los modelos. Preferimos la presentación de modelos completos en lugar de realizar la selección del modelo, ya que los modelos completos muestran la gama completa de predictores investigados (tanto significativos como no significativos) y no es tan probable que inflen el error de tipo I [62].

Además, nuestro conjunto de datos comparativos nos permitió probar otras dos hipótesis específicas presentadas en la literatura. Primero, consideramos la hipótesis del borde telomérico (hipótesis iii [42]), que sugiere que el acortamiento de los telómeros es causal en el proceso de envejecimiento, y cuando los telómeros se acortan demasiado causan la muerte. Aquí, la predicción es que las especies con una longitud media de telómeros corta y tasas de acortamiento de telómeros más rápidas también tendrían una esperanza de vida máxima más corta. Si tal relación está presente en los datos, esto debería resultar en una interacción entre la media de TL y TROC contra la vida máxima de una especie. En segundo lugar, probamos la predicción de que las especies con telómeros más largos pueden exhibir un acortamiento más rápido de los telómeros, lo que se sugirió previamente dentro de las especies (hipótesis iv [63]). Realizamos una regresión filogenética de TL media contra TROC, donde una relación positiva sugeriría que aquellas especies con telómeros más largos también muestran una pérdida de telómeros más rápida.

3. Resultados

La longitud media de los telómeros y el TROC difirieron sustancialmente entre las especies (figura 1, modelo lineal: ambos pag & lt 0,0001). Algunas especies muestran disminuciones muy marcadas en la longitud de los telómeros con la edad, mientras que otras incluso aumentan con la edad. Curiosamente, TROC se asoció fuertemente con la vida útil máxima en todas las especies, y las especies de vida útil máxima más corta tienen una mayor TROC (figura 2a, hipótesis i). Esta relación es robusta a la inclusión de las diferentes covariables probadas (tabla 2). No hubo relación entre la longitud media de los telómeros de una especie y la vida útil máxima (tabla 2 y figura 2B, hipótesis ii). Además, la interacción entre la longitud media de los telómeros y el TROC contra la vida útil máxima específica de la especie no fue significativa (hipótesis iii, interacción: −0,60 ± 0,55 pag = 0,29, también sin la inclusión de la masa corporal, pag = 0,21), lo que sugiere que TROC no es más determinante de la vida útil máxima de las especies en especies con longitudes absolutas cortas de telómeros. El TROC de una especie tampoco se asoció con la longitud media de los telómeros de la especie (tabla 2 y figura 2C, hipótesis iv).

Figura 2. Vida útil máxima observada en función de (a) tasa de cambio de telómeros (TROC) y (B) longitud media de los telómeros en 19 especies de aves. (C) Longitud media de los telómeros representada frente a TROC en 19 especies de aves. Las líneas discontinuas representan las regresiones de las regresiones filogenéticas sin ninguna otra covariable incluida.

Tabla 2. Pruebas para las dos primeras hipótesis (ver §§1,2) en una regresión corregida filogenéticamente (* indica pag & lt 0,05, ± indica s.e.). Los modelos se probaron con y sin masa corporal (log10-transformado) como covariable, y con y sin longitud media de los telómeros como covariable. La tasa de cambio de los telómeros (TROC) es el único predictor significativo y fuerte de la variación máxima de la vida útil entre las especies, con mayores tasas de pérdida de telómeros que se asocian con una vida útil máxima más corta (hipótesis i). TROC no se relacionó con la longitud media de los telómeros de una especie (hipótesis ii).

Se detectó una señal filogenética para TROC (K = 1.21, pag & lt 0.001 figura 3), pero no para la longitud absoluta de los telómeros (K = 0.35, pag = 0,60). Tenga en cuenta que cuando K es mayor que 1 indica que las especies relacionadas filogenéticamente son más similares de lo esperado bajo el movimiento browniano [59].

Figura 3. Evolución del rasgo de la tasa de cambio de telómeros (TROC) mapeada a la filogenia en 19 especies de aves. Los colores indican diferentes niveles del valor del rasgo (los valores transformados se utilizaron para el mapeo, pero los valores lineales se representan con fines ilustrativos en la leyenda). TROC muestra una fuerte señal filogenética y las principales familias o clados de especies que se incluyeron en este análisis muestran tasas similares de pérdida de telómeros con la edad.

4. Discusión

Nuestro estudio confirma informes anteriores de que las especies con mayor TROC tienen una esperanza de vida máxima más corta (hipótesis i [35-37]). Por el contrario, entre las especies muestreadas aquí, la longitud media de los telómeros no se asoció con la longevidad (hipótesis ii). Debido a que TROC explica con tanta precisión la esperanza de vida máxima (tabla 2, figura 2), las causas fisiológicas del acortamiento de los telómeros, o la capacidad de mantener los telómeros, podrían ser parcialmente responsables de las diferentes duraciones de vida observadas en las especies. En apoyo de esta sugerencia, TROC muestra una fuerte señal filogenética, mientras que la longitud absoluta de los telómeros no lo hace, aunque varía ampliamente entre las especies. TROC, en contraste con la longitud absoluta de los telómeros, por lo tanto, parece conservado y seleccionado evolutivamente dentro de las familias de aves. Reconocemos que esta inferencia es menos firme cuando las filogenias son pequeñas, pero la diferencia en la señal filogenética es sorprendente cuando se considera la importancia biológica potencial de la pérdida de longitud de los telómeros en comparación con la longitud absoluta de los telómeros.

El patrón descrito aquí entre TROC y la esperanza de vida puede deberse en parte a la desaparición selectiva, en la que ciertos fenotipos se eliminan preferentemente de una población [41]. Dado que nuestro estudio es de naturaleza transversal debido a la falta de poblaciones de estudio a largo plazo y la larga vida útil de algunas especies, la relación entre TROC y la esperanza de vida podría ser el resultado de la pérdida selectiva de individuos de vida corta del medio ambiente. Esta desaparición selectiva de individuos particulares [41,64], aquellos con telómeros cortos, puede enturbiar la relación entre la pérdida de telómeros y la edad en un contexto transversal [65]. Por ejemplo, la relación positiva entre la longitud de los telómeros y la edad observada en los petreles de tormenta de Leach (O. leucorhoa) se debe muy probablemente a que los individuos de vida más larga comienzan con los telómeros más largos y la variación en la longitud de los telómeros disminuye con la edad debido a la desaparición selectiva de los individuos con telómeros cortos [65]. También es posible que la desaparición selectiva sea responsable de la relación positiva observada en el ostrero euroasiático (H. ostralegus). Es difícil traducir un patrón transversal dentro de una especie a procesos intraindividuales para esa especie. Los estudios longitudinales futuros nos permitirán distinguir entre las diferencias de población que resultan de la eliminación de ciertos fenotipos más temprano en la vida que otros. Por el momento, los estudios longitudinales del envejecimiento en poblaciones de vida libre son raros, pero son necesarios debido a su mayor poder para identificar los cambios relacionados con la edad en comparación con los estudios transversales [31,66,67]. Sin embargo, en un contexto comparativo, los estudios transversales todavía pueden informarnos ampliamente sobre la biología del envejecimiento y la esperanza de vida, aunque perdemos la capacidad de concluir firmemente que estos patrones son el resultado de procesos dentro de los individuos.

El grado en el que la desaparición selectiva difiere entre las especies puede deberse a diferencias en las tasas de mortalidad extrínseca y diferencias en la forma en que la biología de los telómeros influye en la mortalidad relacionada con la edad. Las teorías evolutivas clásicas del envejecimiento predicen que los niveles de mortalidad extrínseca deberían tener una correlación inversa con la esperanza de vida evolucionada [68]. En otras palabras, las especies de vida corta generalmente enfrentan un mayor riesgo de muerte debido a la depredación, el hambre o los accidentes. Dado esto, una interpretación de nuestros resultados es que si hay una desaparición selectiva de individuos con telómeros cortos, este patrón puede estar parcialmente oculto en poblaciones de especies donde los individuos se eliminan de la población debido a procesos aleatorios independientemente de su condición. Esto no quiere decir que la desaparición selectiva basada en la longitud de los telómeros no esté ocurriendo en especies de vida corta, solo que puede ocultarse más fácilmente. Por el contrario, si la erosión de los telómeros aumenta de hecho los riesgos de mortalidad, cabría esperar que esto fuera más evidente en especies longevas con tasas más bajas de mortalidad extrínseca donde la senescencia funcional se observa más fácilmente. Si las diferencias de mortalidad extrínseca son un factor importante de la desaparición selectiva en función de la longitud de los telómeros, esto puede explicar por qué las especies que muestran patrones que se asemejan más a la desaparición selectiva son dos de las especies más longevas que estudiamos, el petrel de tormenta y el ostrero.

Sin embargo, independientemente de las diferencias de las especies en la mortalidad extrínseca, el grado en que la biología de los telómeros afecta los procesos de envejecimiento intrínseco también puede diferir entre las especies, lo que afecta la desaparición selectiva. En otras palabras, algunas especies podrían tener una relación más fuerte entre la biología de los telómeros y las perspectivas de supervivencia en comparación con otras. Por tanto, la desaparición selectiva podría ser más fuerte en especies longevas y para las que la biología de los telómeros es más importante. Por lo tanto, la desaparición selectiva puede deberse tanto a la asociación diferencial de la mortalidad intrínseca con la longitud de los telómeros como a las diferencias en la mortalidad extrínseca que reducen la importancia de la longitud de los telómeros en la determinación de la mortalidad a nivel de población. Independientemente de cualquiera de estas causas, el patrón comparativo que encontramos sugiere que a medida que aumenta la longevidad de una especie, la biología de los telómeros se vuelve cada vez más importante. En el futuro, se necesitan urgentemente más datos longitudinales para desenredar los posibles escenarios descritos anteriormente que pueden resultar en la relación transversal que informamos aquí. Tales esfuerzos nos permitirán comprender más detalles del proceso de deterioro de la senescencia en general [67], y cómo ocurre la desaparición selectiva en especies de diferente duración de vida en particular.

Si bien la desaparición selectiva puede ser parcialmente responsable del patrón que observamos entre TROC y la vida útil, otra posibilidad es que la erosión de los telómeros sea un mecanismo potencial subyacente a la evolución de la vida útil de las aves, y las aves de vida corta pierden más telómeros cada año en comparación con las de vida larga. aves. Un metaanálisis reciente de 14 especies de aves informó que la tasa de pérdida de telómeros se correlaciona con la esperanza de vida máxima estimada a partir de una medida compuesta de rasgos de la historia de vida [36]. Otro estudio reciente, utilizando datos existentes de estudios longitudinales en especies de aves, confirmó una relación negativa entre la tasa de acortamiento de los telómeros y la longevidad máxima [37]. Ambos estudios recientes brindan apoyo adicional a la hipótesis de que el desgaste de los telómeros se correlaciona con tasas interespecíficas de envejecimiento. Los mecanismos subyacentes responsables de esta relación aún se desconocen, y la desaparición selectiva, los mecanismos fisiológicos que mejoran la pérdida de telómeros o alguna combinación de los dos pueden estar en juego.

En la búsqueda de los mecanismos fisiológicos que subyacen a la evolución de la esperanza de vida, los análisis comparativos han revelado que en las especies de aves y mamíferos, las especies con una esperanza de vida más larga también tienen células que son más resistentes a los factores de estrés externos [69] y tienen tasas más bajas de radicales libres mitocondriales. generación [70]. Una posible explicación fisiológica de las diferentes tasas de pérdida de telómeros en las especies de aves de nuestro estudio es que también tenían diferentes niveles de estrés oxidativo. El estrés oxidativo puede aumentar las roturas de una sola hebra en las regiones teloméricas del ADN que pueden causar un acortamiento de los telómeros durante la replicación del ADN debido a una pausa propuesta de la horquilla de replicación [13], aunque este trabajo se basa principalmente en in vitro evidencia, y si tiene en vivo ha sido cuestionada recientemente [71]. Sin embargo, las especies con niveles más altos de estrés oxidativo pueden experimentar un acortamiento más rápido de los telómeros. Curiosamente, esto puede deberse en parte al daño preferencial de los radicales libres a la secuencia telomérica rica en guanina en comparación con otras regiones del ADN [72]. Esto puede permitir que los telómeros actúen como un imán de radicales libres, absorbiendo los radicales libres dañinos mientras protegen las regiones codificantes del cromosoma. En consecuencia, si las especies longevas experimentan niveles más bajos de estrés oxidativo, entonces sus telómeros pueden estar menos expuestos al ataque dañino de los radicales libres.

Otro mecanismo que podría subyacer a la relación entre la tasa de pérdida de telómeros y la vida útil máxima de las especies son los niveles diferenciales de expresión de la telomerasa. En mamíferos, una comparación controlada filogenéticamente en roedores encontró que la actividad de la telomerasa se relaciona con la masa corporal [33]. Otro estudio comparativo de mamíferos confirmó la relación entre la actividad de la telomerasa y la masa corporal y también encontró una relación inversa entre la longitud media de los telómeros y la esperanza de vida [11]. Los autores del estudio sugieren que los telómeros cortos junto con la supresión de la telomerasa son necesarios para la evolución del gran tamaño corporal y la longevidad en los mamíferos, aparentemente como un mecanismo de supresión del cáncer. Curiosamente, mientras que la longitud media de los telómeros varía en un orden de magnitud en las especies que estudiamos (5-50 kb), no encontramos una relación entre la longitud media de los telómeros y la esperanza de vida (hipótesis ii). La falta de una señal filogenética puede sugerir que la longitud de los telómeros evoluciona rápidamente dentro de un linaje, aunque este escenario es poco probable ya que el análisis incluye algunas especies estrechamente relacionadas (Afelocoma y Tachycineta pares de especies, por ejemplo). Otra posibilidad es que el acortamiento de los telómeros sea más importante en cromosomas específicos, pero esa selección es neutra para otros cromosomas. Cada extremo cromosómico contribuye a la longitud media de los telómeros de una especie con el ensayo de TRF en gel, y métodos como el análisis de la longitud de un solo telómero podrían determinar mejor el papel que la longitud de los telómeros en los extremos de un solo cromosoma podría desempeñar en la vida útil.

Estudios previos en aves mostraron niveles más altos de expresión de telomerasa en células de especies con una esperanza de vida máxima más larga [73]. Esto sugiere que las especies de aves de vida más larga pueden haber desarrollado mecanismos que promueven el mantenimiento de los telómeros a través de la expresión de la telomerasa. En comparación con los mamíferos en su conjunto, las aves tienen una masa corporal reducida y una vida relativamente larga. Y se propuso la idea de que un tamaño corporal más pequeño y menos células pueden permitir que las aves tengan una mayor actividad de telomerasa y telómeros más largos sin el alto riesgo de cáncer asociado [40]. Si bien esta idea es intrigante, es fundamental un trabajo más controlado filogenéticamente sobre la variación interespecífica en la expresión de la telomerasa, así como un trabajo experimental comparativo sobre la actividad de la telomerasa en las células tumorales [74,75].

El papel directo de los telómeros en el envejecimiento de los organismos aún no está claro [22]. Si bien el acortamiento de los telómeros puede contribuir directamente a la senescencia [76], tampoco puede haber una relación causal entre la biología de los telómeros y el envejecimiento [22,77]. Recientemente, la hipótesis del borde telomérico (hipótesis iii [42]) postuló un papel causal del acortamiento de los telómeros en la configuración de la longevidad. Específicamente, los autores señalan que las personas que nacen con telómeros cortos también tienen telómeros más cortos en la edad adulta, lo que resulta en un mayor grado de senescencia celular y mortalidad, potencialmente a través de la aterosclerosis.Probamos esta hipótesis en nuestro estudio comparativo de aves, pero no encontramos una relación más fuerte entre TROC y la vida útil máxima para especies con longitudes de telómero promedio cortas. Dado que la aterosclerosis es relativamente común en las especies de aves [78], esto plantea la posibilidad de que los telómeros no jueguen un papel causal en el envejecimiento, sino que sirvan como un biomarcador de otra fisiología relacionada con el envejecimiento [18,69]. Sin embargo, los datos que exploran la pérdida de telómeros a lo largo de la vida de un individuo dentro de una especie son necesarios para evaluar mejor esta hipótesis. Otra hipótesis reciente en la biología de los telómeros es que los telómeros largos se acortan más rápidamente que los telómeros cortos, posiblemente porque los telómeros más largos son más sensibles a los eventos de daño de los telómeros o incluso al daño aleatorio del ADN (hipótesis iv [26,79]). Hasta donde sabemos, esto solo se ha evaluado dentro de las especies, pero entre especies no encontramos apoyo para esta hipótesis. Pero, si bien podríamos esperar que las especies con una longitud promedio de telómeros más larga los pierdan más rápidamente, no podemos explicar las diferencias en los mecanismos de mantenimiento de los telómeros entre las especies, lo que podría nublar estas relaciones.

5. Conclusión

Los estudios comparativos pueden ayudar a identificar la importancia evolutiva de cómo los diferentes mecanismos fisiológicos causan el proceso de envejecimiento. Los resultados de este estudio muestran claramente que las tasas de pérdida de telómeros están fuertemente asociadas con la longevidad de las especies en las aves. Además, esta relación se conserva y selecciona evolutivamente dentro de las familias de aves. Las especies de aves que son más capaces de mantener sus telómeros o, por el contrario, para las que los telómeros están más fuertemente asociados con la supervivencia, provocando una desaparición selectiva, pueden experimentar tasas más bajas de envejecimiento celular y de organismos. Si bien este estudio destaca la conexión entre la biología de los telómeros y el ritmo de vida entre las especies, debemos continuar descubriendo cómo los procesos intraindividuales que afectan el envejecimiento en un contexto ambiental en constante cambio se relacionan con la pérdida de telómeros.

Ética

Todos los procedimientos se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética Animal local correspondiente.


2 métodos

Cuantificamos las longitudes de los telómeros de los dragones pintados machos maduros (Ctenophorus pictus) de cuatro morfos de colores de cabeza diferentes (Figura 1). Los dragones son modelos ideales para esta investigación, ya que tienen una vida corta y envejecen rápidamente (sobreviviendo

1 año en la naturaleza, Olsson, Healey, Wapstra et al., 2007), por lo que es más probable que se detecten intentos de manipular los telómeros (Olsson, Tobler, Healey, Perrin y Wilson, 2012).

Este trabajo se realizó bajo el permiso de Ética Animal 2013/6050 en la Universidad de Sydney. Maduro (

9 meses de edad), los lagartos machos fueron capturados con una soga o con la mano en la Reserva Natural de Yathong, Nueva Gales del Sur, Australia (145 ° 35'E 32 ° 35'S) y trasladados a las instalaciones de la Universidad de Sydney en octubre de 2014, donde fueron alojados durante la duración de los experimentos. Los machos adultos se alojaron individualmente en tinas de plástico opaco (330 × 520 × 360 mm) con sustrato arenoso y se expusieron a un ciclo de luz de 12 h: luz oscura de 12 h. Los machos se alojaron en tres habitaciones diferentes por razones logísticas, pero los morfos se distribuyeron aleatoriamente entre las habitaciones. Los lagartos fueron alimentados con gusanos de la harina y grillos, espolvoreados con calcio y multivitamínicos, hasta la saciedad todos los días y las jaulas se rociaron con agua una vez al día. Se proporcionaron lámparas de calor y pieles cerámicas para permitir que las lagartijas se regularan térmicamente a su temperatura corporal preferida (36 ° C M.O., datos no publicados obtenidos de lecturas de temperatura cloacal en la naturaleza).

2.1 Toma de muestras de sangre

150 μl) se tomaron muestras utilizando un tubo capilar antes y después de la finalización del tratamiento rompiendo el vena angularis (en la comisura de la boca) con la punta de una jeringa. La sangre recolectada se mezcló con heparina y se centrifugó, se extrajo el plasma y se resuspendieron las células restantes con 200 µl de PBS. Se añadió un mililitro de RNAlater (Sigma Aldrich, Australia) y la solución de células sanguíneas diluida para qPCR se almacenó inmediatamente a -80 ° C.

2.2 Cuantificación de la longitud de los telómeros: qPCR

Para analizar la longitud de los telómeros, primero purificamos el ADN de 50 μl del utilizando un DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, Australia), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se añadió RNasa A (Qiagen, Australia) a la concentración recomendada. La concentración de ADN (ng / μl) de cada muestra se midió por duplicado usando un Pherastar FS (BMG, Labtech, Alemania) y alícuotas diluidas a 10 ng / μl usando el tampón AE provisto en el kit de extracción de ADN. A continuación, las muestras se almacenaron a -30 ° C. La longitud de los telómeros se midió mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) utilizando el kit SensiMix SYBR No-ROX (Bioline, Sydney, Australia). Los cebadores de telómeros utilizados fueron Telb1 (5′-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-3 ′) y Telb2 (5′-GGCTTGCCTTACCCTTACCC CrisTTACCCTTACCCTTACCCT-3 ′). El gen del ARN ribosómico 18S (18S) (amplicón de 92 pb en Anolis) fue seleccionado como gen de referencia ya que previamente había sido validado en un reptil (Plot, Criscuolo, Zahn, & Georges, 2012). Las secuencias de cebadores utilizadas fueron 18S-F (5'-GAGGTGAAATTCTTGGACCGG-3 ') y 18S-R (5'-CGAACCTCCGACTTTCGTTCT-3'). Las curvas de fusión producidas tanto para el telómero como para 18S después de la amplificación por qPCR mostraron un solo pico, lo que indica una amplificación específica de la secuencia de ADN. La qPCR se realizó en un volumen final de 20 μl tanto para los telómeros como para el 18S. Se utilizó ADN de 10 ng por reacción y los cebadores se utilizaron a una concentración de 250 nM. Se añadió SensiMix SYBR No-ROX Master Mix (Bioline, Australia) de 11,25 μl por reacción y MgCl2 se añadió para una concentración de reacción de 1,7 mM. Las reacciones se realizaron por triplicado para cada muestra. Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador Rotor-Gene 6000 (Qiagen, Australia) utilizando un paso de activación Taq inicial a 95 ° C durante 10 min, y un total de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 15 s y 72 ° C durante 15 s. Se creó una curva de fusión después de cada ejecución en el rango de temperatura de 60 a 95 ° C para garantizar que no se produzca una amplificación inespecífica del producto. Las reacciones de control sin molde se realizaron por triplicado para cada juego de cebadores durante cada ejecución de qPCR para asegurar que no haya contaminación. Se crearon curvas estándar, utilizando la sangre de un lagarto seleccionado al azar, tanto para los telómeros como para el 18S para garantizar tasas consistentes de amplificación en una amplia gama de concentraciones de ADN. La reacción se consideró consistente cuando una línea recta con una R 2 superiores a .985 podrían ajustarse a los valores obtenidos. Se crearon diluciones seriadas triples, comenzando con una concentración de 26,67 ng / μl hasta 0,037 ng / μl, con siete concentraciones diferentes en total (Figura complementaria S1) que dan un rango dinámico lineal de 0,037-26,67 ng / μl. La eficiencia de la amplificación de los telómeros fue de 1.05 y la eficiencia de la amplificación de 18S fue de 0.96. Todas las muestras cayeron dentro del rango de concentración generado por la curva estándar. En todas las ejecuciones, los controles sin plantilla tenían un valor de Cq al menos 10 veces mayor que la muestra más baja medida, lo que indica que el ADN contaminante constituía un máximo de aproximadamente el 0,001% de la concentración de ADN original. LinRegPCR 2015.2 (Ruijter et al., 2009 Tuomi, Voorbraak, Jones y Ruijter, 2010) se utilizó para analizar los datos de qPCR. LinRegPCR calcula las concentraciones iniciales individuales en función de la eficiencia media de un amplicón, la fluorescencia de referencia y los valores del ciclo umbral. Las concentraciones iniciales de telómero (T) y gen de control (S 18S) se utilizaron para determinar la longitud relativa del telómero con el cálculo T / S. Los telómeros y el gen de control se evaluaron en experimentos separados. Los coeficientes medios de variación interensayo para las corridas de qPCR para telómeros (norte = 13) y 18S (norte = 13) la amplificación fue de 16,73% y 38,21%, respectivamente, calculados utilizando una muestra de referencia a 10 ng / μl que se incluyó en todas las ejecuciones. Debido al alto coeficiente interensayo para las ejecuciones 18S, verificamos los valores individuales y encontramos un valor atípico que infló el coeficiente interensayo. Cuando se eliminó este valor atípico, el coeficiente medio entre ensayos fue del 23,52%. Para probar si este valor era más confiable, calculamos un nuevo coeficiente medio interensayo basado en un estándar de la curva estándar que se incluyó en todas las ejecuciones a una concentración de 8,89 ng / μl. En estas condiciones, el coeficiente medio interensayo fue del 22,30%. Esto sugiere que el coeficiente interensayo medio real para 18S fue aproximadamente del 23%. La media (±Dakota del Sur) los coeficientes de variación intraensayo para las series de telómeros y 18S fueron 14,63 ± 0,1% y 12,52 ± 0,09%, respectivamente. Media (±Dakota del Sur) las eficiencias de amplificación generadas por LinRegPCR a través de los telómeros y las series de qPCR 18S fueron 1,89 ± 0,04 y 1,98 ± 0,01, respectivamente. Los valores de eficiencia de LinRegPCR se pueden comparar con la eficiencia obtenida mediante una curva estándar restando 1. La diferencia de eficiencia entre la curva estándar y el método LinRegPCR probablemente se deba al ajuste manual de Cq en el método de curva estándar.

2.3 Análisis estadístico

Para el análisis de los efectos específicos de la morfo en la longitud de los telómeros, los datos de qPCR se ingresaron primero en un análisis de modelo mixto en Proc MIXED SAS 9.4 (SAS Institute) utilizando la longitud de los telómeros en febrero (fecha de finalización del experimento) como variable de respuesta, el predictor fijo los factores se transforman (amarillo, naranja, rojo y azul) y el babero (con y sin biberón), y con la habitación en la que se colocó una lagartija (numerada del 1 al 3) como factor aleatorio. Cuando "espacio" no fue significativo en una prueba de razón de verosimilitud (χ 2 & lt 1, pag & gt .9), realizamos el análisis correspondiente en Proc GLM (con el fin de obtener R 2 valores para nuestros análisis). La longitud de los telómeros en diciembre se utilizó como covariable, que controlaba la longitud de los telómeros al inicio del período experimental. Esto también limita el análisis a los telómeros no intersticiales, ya que mide efectivamente el cambio en la longitud de los telómeros (bajo el supuesto de que los telómeros intersticiales no cambian durante el período experimental). Dicho esto, no sugerimos que los telómeros intersticiales sean irrelevantes para la viabilidad y otros efectos de aptitud bajo selección en asociación con la dinámica de los telómeros. Los datos obtenidos de este experimento se archivarán en Dryad.


El posible papel de los telómeros en el corto período de vida de la vieira de la bahía, irradiadores de Argopecten irradiadores (Lamarck 1819).

Se han desarrollado varias teorías sobre el envejecimiento a lo largo de los años. Pearl (1928 citado en Carlson & amp Riley 1998) vio una relación inversa entre la longevidad y el metabolismo, con los resultados dañinos de una tasa metabólica excesiva que conduce a una desaparición más temprana. La teoría de los radicales libres, presentada por Harman (1956), establece que los productos altamente reactivos del metabolismo, como las especies reactivas del oxígeno (ROS), pueden dañar los tejidos. Otra teoría asume que la constante avalancha de agresiones ambientales (p. Ej., Radiación solar, efectos tóxicos de los materiales ingeridos y similares) provocan daños en el ADN que sobrepasan la capacidad del cuerpo para repararlo (Carlson y Riley 1998). Un cuarto sugiere que los genes que producen características favorables en la vida temprana pueden volverse dañinos después de la reproducción (Rose 1991). Los avances recientes en el campo de la biología molecular han dado lugar a nuevos métodos de estudio del envejecimiento en eucariotas. Se ha demostrado que los telómeros, repeticiones de nucleótidos que se encuentran al final de los cromosomas, actúan como un reloj "mitótico" que puede definir la duración de la vida de una especie (Blackburn 1991, Harley 1991, Wright y Shay 2005). Con cada ronda de replicación celular, se pierden varios telómeros (Blackburn 1991, Levy et al. 1992).

La senescencia puede ocurrir cuando la longitud de los telómeros alcanza una longitud crítica, induciendo cambios que se asemejan a las roturas del ADN y la posterior detención del punto de control (Zou et al. 2002). Aunque no se ha dilucidado la conexión exacta entre la pérdida de telómeros y la senescencia celular, se sabe que la proteína de control del ciclo celular, p53, se encuentra cerca de los telómeros (Levine et al. 1993), y otros estudios han mostrado una relación entre la pérdida de telómeros y envejecimiento (Kulju & amp Lehman 1995, Vaziri & amp Benchimol 1996, Whikehart et al. 2000). Ha habido algunos estudios que correlacionan los telómeros más largos con una supervivencia más larga. Los experimentos han demostrado que la reconstitución de la telomerasa activa en las células produce telómeros alargados y una vida útil prolongada en el cultivo de tejidos humanos (Bodnar et al. 1998, Vaziri & amp Benchimol 1998). Joeng y col. (2004), sobreexpresaron la proteína de unión a telómeros, HRP-1 en el gusano Caenorhabditis elegans, lo que resultó en telómeros más largos y una vida posterior más larga. Se ha demostrado que las golondrinas de árbol (Tachycineta bicolor) con telómeros más largos viven más que aquellas con telómeros más cortos (Haussmann et al. 2005). Por el contrario, los experimentos que evitaron que la telomerasa agregara más telómeros a los extremos de los cromosomas dieron como resultado el acortamiento de los telómeros y la muerte celular (Herbert et al. 1999).

El envejecimiento en muchos invertebrados y algunos vertebrados no existe (es decir, estos animales simplemente continúan creciendo y reproduciéndose hasta que las condiciones ambientales, las enfermedades o la depredación finalmente terminan con sus vidas). Klapper y col. (1998a) descubrieron la enzima telomerasa en todos los tejidos de la langosta, Homarus americanus. Del mismo modo, Koziol et al. (1998) encontraron altos niveles de telomerasa en los tejidos de las esponjas estudiadas. La trucha arco iris, Oncorhynchus mykiss, se considera "inmortal" debido a su distribución similar de telomerasa (Klapper et al. 1998b). Normalmente, las especies con un período de vida definido no exhiben actividad telomerasa en sus células somáticas, y la posterior pérdida de telómeros determina la duración de sus vidas (Harley et al. 1992, Shay & amp Wright 2000). Las edades de supervivencia de algunos moluscos bivalvos comerciales varían desde menos de dos años en el género Argopecten, (Belding 1910) hasta la almeja de aguas profundas, Artica islandica, cuyos especímenes vivos han tenido una edad de más de 150 años (Thompson et al. . 1980, Cuerdas 1985). Otro bivalvo de aguas profundas de larga vida, Tindaria callistifomis, alcanza una longitud promedio de 8,4 mm después de 100 años y es sexualmente maduro después de 50 60 años (Turekian et al. 1975). Actualmente se desconoce si estos moluscos tienen telomerasa en todos sus tejidos, como se ve en la langosta, o si tienen un recambio celular mucho menor debido a su entorno de aguas profundas junto con un complemento suficiente de telómeros. La investigación ha demostrado que los moluscos representativos demuestran la misma repetición telomérica, [(TTAGGG) n] que se encuentra en todos los vertebrados estudiados hasta la fecha (Meyne et al. 1989). Por ejemplo, la ostra. Crassostrea gigas, (Guo & amp Allen 1997), la vieira, los irradiadores Argopecten (Estabrooks 1999), la almeja cuña, Donax trunculus, (Plohl et al.2002), y los caracoles terrestres, Cantareus aspersus y C. mazzullii, ( Vitturi et al.2005), todos comparten esta misma secuencia. Sin embargo, hasta la fecha no se han realizado estudios que demuestren una correlación de la edad y la senescencia con la longitud de los telómeros en los moluscos. Epp y col. (1988) buscaron las posibles causas de la senescencia en la vieira de la bahía, A. irradians y postularon que podría haber una conexión entre el metabolismo de las proteínas y los ciclos neurosecretores que resultan en una posible alteración neuroendocrina. Barber y Blake (1986), especularon que el alto costo de reproducción puede acelerar el proceso de senescencia en la subespecie del sur, A. irradians concentrieus. Bricelj y col. (1987b) concluyó que la senescencia en la vieira de segundo año no estaba relacionada con los costos metabólicos de un próximo segundo esfuerzo reproductivo.

El estudio actual comparó los telómeros de dos especies de Argopecten estrechamente relacionadas. a saber, A. purpuratus, capaz de sobrevivir de 7 a 10 años o más (DiSalvo et al. 1984, Alarcon & amp Wolff 1991), y A. irradians irradians, con una vida útil inferior a 2 años. El género Argopecten se escindió hace unos 19 millones de años durante el Mioceno medio (Waller 1969), mientras que Argopecten purpuratus, que se encuentra frente a las costas de Perú y Chile, surgió hace aproximadamente 6 millones de años y se separó de la población atlántica con el cierre. de la conexión Atlántico-Pacífico al final del Mioceno, mientras que los irradiadores de Argopecten se separaron hace alrededor de 1,5 millones de años durante el Pleistoceno cuando el aumento del nivel del agua produjo las bahías y los sonidos de hoy (Waller 1969). Después de confirmar primero que la secuencia telomérica de A. purpuratus era la misma que la de A. irradianos [(TTAGGG) n], se compararon las longitudes de los telómeros como una posible explicación de la diferencia en sus respectivas vidas. Además, las secuencias subteloméricas de A. irradianos se compararon con las de Placopecten magellanicus, una especie con el número modal de n = 19, que surgió hace unos 65 millones de años. Se ha demostrado que cuanto más reciente es la especie, más numerosos son los parches subteloméricos que son sitios de altas tasas de recombinación intercromosómica y con resultados tanto positivos como negativos (Rocco et al. 2001, Linardopoulou et al. 2005).

Se presenta un argumento sobre los posibles beneficios de extender la vida útil de los irradiadores Argopecten a través del alargamiento de los telómeros como un enfoque adicional para la recuperación de la población y el mantenimiento de densidades de población adecuadas en esta especie.

Se recolectaron de tres a cuatro vieiras pertenecientes a cada cohorte de A. irradiadores a intervalos de aproximadamente seis meses en el mismo lugar en Nantucket Harbour, MA. Esto aseguró que todas las comparaciones de las longitudes de los telómeros fueran de vieiras con una diferencia de edad de aproximadamente un año. Se obtuvieron muestras de Argopecten purpuratus gracias a la generosidad de Karin Lohrmann Sheffield de la Universidad Católica del Norte en Chile y Louis DiSalvo de Chile. El ADN se extrajo de la glándula digestiva, el riñón, el músculo aductor, el corazón y los tejidos branquiales mediante el método que utiliza DNAzol (Molecular Research, Inc., Cincinnati, OH), véase Estabrooks (1999). o una ligera modificación del método de Sokolov (2000) que produce grandes cantidades de ADN libre de mucopolisacáridos que a menudo se encuentran en el tejido de moluscos. En el último método, pequeñas cantidades de muestras de tejido, 50-70 [micro] g en tubos de 1,5 ml, se homogeneizaron brevemente en 1,0 ml de reactivo de lisis (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, 1% dodecil sulfato de sodio (SDS), 0,2-0,4 mg / ml de proteinasa K) y se incubó durante 2 ha 55 ° C. Se añadieron 100 µl de KCl saturado, se mezclaron y los tubos se colocaron en hielo durante 5 min. Después de centrifugar a x 14.000 g, el sobrenadante se transfirió a nuevos tubos y se extrajo dos veces con un volumen igual de fenol: cloroformo: alcohol isoamílico (25: 24: 1) utilizando el sistema Eppendorpf Phase-Lok (Westbury, NY). A continuación, el sobrenadante se transfirió a un tubo nuevo y el ADN se precipitó con una cantidad igual de etanol al 100%, se lavó dos veces en etanol al 70%, se escurrió y se reconstituyó con tampón TE, pH 8,0. Se añadió RNasa A a 0,2 mg / ml y luego se cuantificó el ADN a 260/280 nm con un espectrofotómetro Beckman DU7. Se cortaron cantidades conocidas de ADN con las enzimas de restricción RsaI (Sigma-Aldrich, St.Louis, MO) e HinfI (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) de acuerdo con las recomendaciones de los fabricantes y sometidos a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% durante aproximadamente una hora a 105 V. Cada ciclo electroforético consistió en ADN de vieiras del año 1 y año 2 tomadas en diferentes momentos del puerto de Nantucket. Las vieiras en cada grupo de edad eran de la misma área del puerto y, por lo tanto, de la misma cohorte, lo que ayudó a asegurar una diferencia de edad de 12 meses en cada momento de muestreo. A continuación, el ADN se transfirió a membranas de nailon mediante transferencia Southern en NaOH 0,4 M, se enjuagó brevemente en 2x SSC y se secó al aire entre hojas de papel de filtro 3MM. Luego, la membrana se horneó a 80 ° C durante 30 min para fijar el ADN a la membrana. Los telómeros se detectaron utilizando el procedimiento quimioluminiscente descrito en Estabrooks (1999). Las longitudes medias de los telómeros se estimaron utilizando marcadores de peso molecular (kb) incluidos en cada ejecución.

Los telómeros se expresan como fragmentos de restricción de telómeros (TRF) porque se cortan de los extremos del cromosoma por enzimas de restricción en un punto debajo del segmento telomérico más interno (TTAGGG) y pueden contener una pequeña cantidad de ADN no telomérico.

La Figura 1 sigue la disminución de la longitud de los telómeros de la glándula digestiva de los irradiadores Argopecten en comparación con la de A. purpuratus. Un año 1 A. irradiadores es de 0-12 meses, momento en el que generalmente está sexualmente maduro y listo para desovar. Las mediciones semicuantatativas determinaron que la longitud promedio de los telómeros para A. purpuratus (2 años) era de aproximadamente 9,4 kb. Un ensayo de telómero representativo para A. irradiadores a aproximadamente 6 meses de edad produjo una longitud de 2,3 kb y 0,75 kb para A. irradiadores a los 18 meses. Se recolectaron muestras de cohortes de A. irradiadores del año 1 y del año 2 en el puerto de Nantucket. Esto aseguró que todas las comparaciones de las longitudes de los telómeros fueran de vieiras con aproximadamente un año de diferencia de edad y todas demostraron una gran caída en las longitudes de los telómeros entre las dos cohortes. En ningún momento una vieira del año 2 tuvo telómeros más largos que los de cualquier año 1, y solo el tejido de la glándula digestiva mostró las diferencias dramáticas en la longitud, probablemente debido a una tasa mucho más alta de recambio celular.

Una vieira del año 2 es de 13 a 24 meses, pero generalmente no sobrevivirá para completar un segundo año. Los TRF de una vieira que entra en su tercer año (24 meses más) se muestran en la Figura 2, comparando los de su tejido cardíaco con los de la glándula digestiva. El músculo cardíaco no se divide, por lo que muestra un grupo uniforme de telómeros largos (PM alto) que no se acortan con la edad, mientras que la glándula digestiva tiene muy pocos telómeros de cualquier longitud. El nivel de telómeros en los músculos aductores de dos cohortes de A. irradiadores también sigue siendo el mismo que cabría esperar, ya que el tejido muscular generalmente no se replica (Fig. 3).

La Figura 4 compara los telómeros de la glándula digestiva de la vieira de aguas profundas de larga vida, Placopecten magellanicus (4 años) con los de una vieira de un año. Nótese la escasez de secuencias subteloméricas en P. magellanicus, lo que respalda la teoría de que cuanto más reciente es la especie, más secuencias subteloméricas pueden encontrarse (Meyne et al. 1990, Rocco et al. 2001).

El número de cromosomas de las especies existentes de vieiras tiene el número modal de haploides, n = 19, mientras que las vieiras de la bahía, A. irradians y A. purpuratus tienen n = 16 (Wada 1978, Gajardo et al. 2002). Esta reducción en el número de cromosomas puede deberse a la fusión robertsoniana, en la que los cromosomas telocéntricos se fusionan, reduciendo el número total de cromosomas (Wang & amp Guo 2004). También señalaron que los A. irradiadores incurrieron en pérdidas de brazos cromosómicos de casi el 50% en comparación con el número modal 2 n = 38, y sugirieron que un bivalvo ancestral puede haberse vuelto tetraploide en algún momento como una explicación de cómo Argopecten fue capaz de soportar pérdidas cromosómicas tan extensas y aún sobrevivir.

La mayoría de las especies de vieiras estudiadas hasta la fecha tienen el número de cromosomas modales n = 19 y viven más tiempo que las vieiras (Beaumont & amp Zouros 1991). Se sugiere que el material de ADN clave involucrado en la longevidad puede haberse perdido en algunas especies de vieiras en el camino, dejando a los A. irradiadores con lo suficiente para sobrevivir a un solo esfuerzo reproductivo.

Como prueba adicional, Rocco et al. (2001) demostraron un número creciente de secuencias subteloméricas de TTAGGG en varias especies de Condrictios en diferentes etapas de evolución que dieron como resultado una reducción cromosómica. Este puede ser el caso de la vieira. Cuanto más reciente es la especie, más secuencias teloméricas internas se ven (Meyne et al. 1990). Curiosamente, no se encontraron secuencias de TTAGGG intersticiales en la ostra, Crassostrea gigas (n = 10), un bivalvo más primitivo (Guo y Allen 1997), o en C. angulata (Cross et al. 2005), mientras que el estudio actual (Fig. 4) pudo demostrar su presencia en los A. irradiadores más recientes (1,5 millones de años) y solo ligeramente en la vieira de aguas profundas, P. magellanicus (65 millones de años). Zou y col. (2002) que se encuentran en una especie de ciervo, las secuencias de telómeros internos (subteloméricos) también son sitios de fragilidad que pueden ser restos de la fusión robertsoniana que en realidad pueden contribuir a una mayor inestabilidad cromosómica. En los humanos, aproximadamente el 50% de todas las secuencias subteloméricas se generaron después de la divergencia chimpancé / humano (Linardopoulou et al. 2005).

A. los irradiadores a menudo se etiquetan como semelparas (Barber & amp Blake 1986, Bricelj et al. 1987a, Estabrooks 1999, Tettelbach et al. 1999 entre otros), pero no parece haber una ventaja selectiva para que la vieira de bahía tenga una vida tan corta. Por lo general, se encuentra una existencia semelparosa cuando existe la necesidad de poner toda la energía de uno en un solo esfuerzo reproductivo y la muerte resulta poco después. Esto se ve, por ejemplo, en el salmón del Pacífico, Oncorhynchus spp., En el que toda la energía necesaria para el proceso reproductivo se trae desde el océano en forma de nutrientes almacenados para ser utilizados río arriba (Morbey et al. 2005). . Por el contrario, la vieira entra en su segundo año posterior al desove al duplicar su peso desde septiembre hasta finales de noviembre (Bricelj et al. 1987b, Tettelbach et al. 2002). Los lípidos, los carbohidratos y las proteínas se almacenan durante el invierno, y muchos pueden sobrevivir para al menos iniciar la gametogénesis a principios de la primavera, aunque la mayoría de las veces sobreviven para completar un segundo desove (Belding 1910). Bricelj & amp Krause (1992) encontraron una alta tasa de supervivencia hasta una segunda temporada reproductiva sin completarse (90% sobrevive hasta marzo). A. los irradiadores parecen ser tomados por sorpresa, por así decirlo, defraudados por deleciones teloméricas, quizás mejor etiquetado como un caso de "interruptus iteroparous".

La teoría darwiniana inferiría que este rasgo único de la historia de la vida (reproducción) se ha optimizado con el tiempo, pero una visión más realista puede sugerir que las limitaciones fisiológicas de vivir bajo oportunidades específicas de la especie podrían producir una estrategia que, aunque no es óptima, sigue siendo " suficientemente bueno "(Darlington 1977, Tuomi et al. 1983). Se postula que al menos parte del material cromosómico clave perdido con el tiempo fueron telómeros. La glándula digestiva productora de energía con sus células que se dividen rápidamente parece ser el órgano clave para perder suficientes telómeros para iniciar la senescencia y la posterior muerte de la vieira. Al comparar los telómeros de la glándula digestiva de un Argopecten purpuratus de dos años con los de los irradiadores Argopecten de primer y segundo año, se puede ver que A. purpuratus tiene telómeros más largos (Fig. 1). Las estimaciones semicuantitativas muestran que un A. purpuratus de dos años contiene longitudes de fragmentos de restricción de telómeros (TRF) que son mucho más largas que las de los A. irradiadores de primer año. La Figura 3 muestra telómeros aún más cortos en la glándula digestiva de A. irradiadores entrando en su tercer año. Los telómeros del corazón y el músculo aductor no se acortan, ya que estos tejidos generalmente no experimentan división celular (Fig. 3, 4).

Las branquias y el riñón también muestran pérdidas de telómeros como se esperaría, pero no en la medida en que se observa en la glándula digestiva (datos no mostrados). Esto podría explicarse en el riñón, ya que este órgano almacena numerosos gránulos de excreción que se depositan capa por capa durante un período prolongado para finalmente ser expulsados ​​en el tracto urinario (George et al. 1980, Morse 1987). Este proceso daría como resultado un recambio celular más lento y menos telómeros perdidos.

Mientras que la hora final de la muerte puede ser causada por variaciones en el medio ambiente junto con la condición de las vieiras individuales como sugirieron Bricelj et al. (1987b), lo más probable es que la pérdida de telómeros sea el ajuste aproximado del reloj mitótico que determina el promedio de vida de esta especie. El ajuste fino puede estar modulado por varios factores, como el número inicial de telómeros y la tasa individual de renovación celular. Las vieiras en aguas más profundas y frías pueden tener una tasa de metabolismo más lenta, mientras que las que se reproducen más tarde en la temporada enfrentarán diferentes condiciones en diferentes momentos de sus vidas. Aquellos que almacenan menos nutrientes para el segundo invierno próximo pueden estar en una condición más débil, como sería el caso de los infectados con parásitos.

Esto también podría explicar las observaciones de que la senescencia en las vieiras puede estar relacionada con el tamaño y con la edad (Gutsell 1930, Orensantz 1986, Bricelj et al.1987b) con vieiras más pequeñas que sobreviven más tiempo por haber tenido menos replicaciones celulares y, por lo tanto, menos telómeros perdidos.

La mortalidad de la vieira de la bahía puede ocurrir durante un período de hasta varios meses, generalmente comenzando a principios del invierno y hasta la primavera en el noreste (Belding 1910, Bricelj et al. 1987b). Se cree que otras teorías del envejecimiento, incluida la acumulación de errores genéticos a lo largo del tiempo, el daño causado por los radicales libres o una tasa metabólica excesiva pueden tener sus efectos en la definición de la fecha de muerte de las vieiras individuales, pero no en la esperanza de vida general. de la especie.

Se propone que A. irradians tiene el potencial de una vida más larga, y solo la desafortunada pérdida de material cromosómico clave de un relicto tetraploide original evita que lo haga. Una consecuencia de evolucionar a una especie que se ha adaptado a bahías poco profundas puede haber sido la pérdida de secuencias teloméricas clave. Parece hacer todos los preparativos necesarios para sobrevivir durante el próximo invierno y más allá, pero rara vez vive para completar una segunda temporada reproductiva. La manipulación genética para aumentar el número de telómeros en A. irradiadores posiblemente podría otorgar a la vieira de la bahía varias oportunidades reproductivas adicionales que podrían ayudar a mejorar el impacto de algunas catástrofes larvarias en las que no hubo pérdidas catastróficas concomitantes de la población reproductora.

Esto lleva a la pregunta de que si una vida útil prolongada podría ser la respuesta a algunos de los problemas que enfrentan los A. irradiadores, ¿qué tan exitoso es A. purpuratus en Chile? La industria allí se enfrenta a un conjunto diferente de problemas para mantener un nivel umbral exitoso de vieiras en la naturaleza, principalmente el de la extracción ilegal. Las cohortes de todo el año se consideran semillas y son capturadas indiscriminadamente por buzos (Stotz & amp González 1997), dejando que la acuicultura represente la mayor parte de la producción de vieiras hoy en Chile (von Brand et al. 2006). Los cruces genéticos de A. irradians irradians y A. purpuratus pueden tener la posibilidad de extender la vida útil de los primeros. Ambas son especies de agua fría con n = 16 y cariotipos idénticos, 5º (subtelocéntrico) y 11t (telocéntrico) (Gajardo et al. 2002, Wang & amp Guo 2004). Waller (1969), afirma que A. purpuratus, que es de 4,5 a 5 millones de años mayor que los A. irradiadores, ha sufrido pocos cambios a lo largo del tiempo. Además, Chen et al. (1991) encontraron que el 90% de los cruces entre Chlamys farreri (n = 19) y A. irradians (n ​​= 16) sobrevivieron hasta 12 días. Parece razonable esperar que un cruce entre A. irradians y A. purpuratus resulte mejor. El evento de El Niño de 1983, cuando la temperatura ambiente del agua aumentó dramáticamente, resultó en un aumento de sesenta veces en la población normal de vieiras. Wolff (1987), ha sugerido que A. purpuratus, una especie de agua normalmente fría, puede haber retenido muchas de sus características de agua cálida del Mioceno tropical / subtropical. Si esto es cierto, un cruce entre A. purpuratus y A. irradians concentricus (Say) o A. irradians amplicostatus (Dahl), puede producir resultados similares. Actualmente, se están realizando investigaciones para determinar la viabilidad de los cruces entre A. irradians irradians y A. purpuratus y medir los telómeros resultantes, si dichos cruces tienen éxito.

El autor agradece a la Dra. Sarah Oktay de la Estación de Campo de la Universidad de Massachusetts y a Valerie Hall por sus aportes críticos. Esta investigación fue apoyada por subvenciones del Departamento de Recursos Marinos y Costeros de Nantucket y la Fundación PADI.

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STEPHEN L. ESTABROOKS * Laboratorio marino de Nantucket, 0 Easton Street, Nantucket, Massachusetts 02554


Agradecimientos

Agradecemos a Johanna Borlid por su ayuda con el trabajo molecular, a Benjamin Goh, Krista Woodward y Geordia Rigter por mantener las poblaciones de peces y el muestreo, a Britt Wassmur por compartir secuencias de cebadores de beta-actina, y al editor y dos revisores anónimos por sus comentarios constructivos. El estudio fue apoyado por Formas (21.5 / 2002-1037 y 215-2009-463, DB 2008-383, JIJ), financiamiento de Oscar och Lili Lamms Minne (FO2009-0007 y FO2012-0039, AP), Carl Tryggers Stiftelse ( CTS 09: 294, AP), así como por el Sistema Regulador Canadiense de Biotecnología (RHD).


Resultados

Determinación de la edad por recuento de GLG

Las edades cronológicas estimadas para 24 colmillos por recuento de GLG variaron de 5 a 69 años (Tabla 1) y se utilizaron para determinar correlaciones entre edad, rTL y morfometría corporal.

IDENTIFICACIÓN Información de varamiento Información corporal Edad * (año)
Fecha (M / D / A) Localización Sexo Longitud (cm) Cuerpo (kg)
307 24 de enero de 2010 Isla Libong, Trang Mujer 277 358 54
300 5 de octubre de 2009 Playa Samran, Trang Mujer 224 235 11
299 28 de septiembre de 2009 Isla Libong, Trang Mujer 281 335 63
292 2/2009 Playa de Ao Nang, Krabi Mujer 282 305 41
291 1 de febrero de 2009 Isla de Ko Sarai, Satun Mujer 263 317 67
285 26 de julio de 2008 Mapa de Ta Phut, Rayong Mujer 200 24
283 9 de abril de 2005 Isla Ko Lanta Yai, Krabi Mujer 300 38
272 30 de agosto de 2007 Sattahip, Chonburi Masculino 245 13
258 12 de agosto de 2006 Bang Sare, Chonburi Mujer 231 200 12
243 26 de diciembre de 2004 Isla Ko Pa Yung, Phangnga Masculino 275 310 23
236 1 de junio de 2004 Isla de Ko Klang, Phangnga Mujer 250 69
234 22 de abril de 2004 Isla Ko Yao, Phangnga Mujer 256.5 297 27
143 28 de noviembre de 2001 Isla Libong, Trang Mujer 199.5 142 5
129 6 de diciembre de 2000 Khao Mai Kaeo, Trang Mujer 225 258 43
098 14 de octubre de 1998 Kram, Rayong Masculino 214 180 16
084 3 de agosto de 1998 Wichit, Phuket Masculino 219 184 8
078 19 de mayo de 1998 Lamae, Chumphon Mujer 231 151 34
058 6 de enero de 1997 Isla Libong, Trang Masculino 250 245 15
057 2 de enero de 1997 Isla Libong, Trang Mujer 258 281 14
048 3 de marzo de 1996 Suk Samran, Ranong Mujer 271 293 43
047 25 de enero de 1996 Isla Ko Yao, Phangnga Masculino 221 143 6
038 21 de junio de 1995 Isla Libong, Trang Masculino 257 250 14
036 31 de marzo de 1995 Bo Hin, Trang Mujer 273 272 34
016 11 de mayo de 1993 Muang Krabi, Krabi Masculino 254 16

Determinación de la variabilidad de la medición de rTL

En el presente estudio, probamos la variabilidad de la medición de rTL usando PCR en tiempo real y si fue causada por diferencias en el diseño experimental o factores biológicos como se muestra en la Tabla 2. Nuestros resultados revelaron CV más bajos obtenidos de muestras intraindividuales en ambas edades. grupos en comparación con valores interindividuales. Estos resultados sugieren que aunque el error del experimento tuvo una variabilidad relativamente grande, el factor biológico (edades) pareció ser el factor principal que explica la variabilidad en rTL.

Escenario Intraindividual (%) Interindividual (%)
Prematuro (& lt20 años) 38.97 47.02
Maduro (≥20 años) 37.44 91.65
Media general 38.20 69.34

Correlación entre edad y recuentos de GLG, rTL y morfometría corporal

Se aisló ADN de 24 muestras de piel de dugongo para medir la longitud de los telómeros mediante PCR en tiempo real; sin embargo, solo hubo amplificación positiva en 14 muestras (56%). Pero los 24 colmillos de dugongo fueron envejecidos según los conteos de GLG. Utilizando la regresión logística, se encontraron correlaciones positivas entre la edad estimada por los recuentos de GLG y tanto el peso corporal como la talla, con valores límite de aproximadamente 309 kg y 266 cm, respectivamente (Figs. 3A y 3B Tabla 3). Por el contrario, la relación entre la edad según los recuentos de GLG y rTL se ajusta a una curva logística negativa, por lo que el aumento de la edad se asoció con la disminución de la longitud de los telómeros (Fig. 3C Tabla 3). Se observaron correlaciones negativas entre rTL y el peso y la longitud corporal, con un ajuste R 2 de 0.43 (pag & lt 0,0001) y 0,51 (pag & lt 0,0001), respectivamente, para la función de logaritmo del modelo (Figs. 3D y 3E Tabla 3). El peso corporal y la longitud se correlacionaron positivamente con un ajuste R 2 de 0,78 (Fig. 3F Tabla 3). Además, evaluamos el rendimiento del modelo obtenido a partir de la determinación de la edad por rTL utilizando una regresión lineal para probar la correlación entre la edad predicha de rTL y la edad de los recuentos de GLG, lo que resultó en una R 2 de 0.86 y error estándar residual de 6.33 (Fig. S1).


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