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¿Qué es una pantalla funcional?

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Estaba revisando este artículo, pero no entendí un término.
¿Cuál es el significado de pantalla funcional?

(No soy estudiante de biología, no entiendo mucho, y una pequeña explicación simple sería suficiente)


Del resumen del artículo vinculado (Guttman, 2002):

Utilizamos un cribado genético in vivo para identificar 13 efectores […]. Aunque comparten poca homología general, las regiones amino-terminales de estos efectores tenían composiciones de aminoácidos sorprendentemente similares.

Y del cuerpo:

El cribado se basó en la señal de secreción de tipo III y el promotor endógeno del gen del lúpulo y, por tanto, fue muy específico.

Por lo tanto, los autores buscan e identifican proteínas con una señal secretora bajo la regulación de un promotor de lúpulo. A pantalla funcional en este trabajo se refiere a la análisis de muestras de proteínas para detectar la presencia de proteínas con una función particular.


Las pantallas multiplex enCas12a detectan el almacenamiento en búfer funcional entre parálogos que de otro modo estarían enmascarados en pantallas de eliminación de Cas9 monogénicas

El cribado agrupado de la biblioteca CRISPR / Cas9 knockout a través de cientos de líneas celulares ha identificado genes cuya alteración conduce a defectos de aptitud, un paso crítico en la identificación de posibles objetivos de cáncer. Sin embargo, el número de genes esenciales detectados a partir de estas pantallas de desactivación monogénica es bajo en comparación con el número de genes expresados ​​constitutivamente en una célula.

Resultados

A través de un análisis sistemático de los datos de la pantalla en líneas de células cancerosas generadas por el Mapa de dependencia del cáncer, observamos que la mitad de todos los genes expresados ​​constitutivamente nunca se detectan en ninguna pantalla CRISPR y que estos elementos nunca esenciales están altamente enriquecidos para los parálogos. Investigamos el almacenamiento en búfer funcional entre aproximadamente 400 pares de parálogos candidatos utilizando el cribado de desactivación de genes dobles CRISPR / enCas12a en tres líneas celulares. Observamos 24 pares de parálogos letales sintéticos que han escapado a la detección por pantallas de desactivación monogénica en umbrales estrictos. Diecinueve de 24 (79%) interacciones letales sintéticas están presentes en al menos dos de cada tres líneas celulares y 14 de 24 (58%) están presentes en las tres líneas celulares probadas, incluidas subunidades alternativas de complejos de proteínas estables y funcionalmente redundantes enzimas.

Conclusiones

Juntas, estas observaciones sugieren fuertemente que los parálogos funcionalmente redundantes representan un conjunto de dependencias genéticas que pueden ser diana y que están sistemáticamente infrarrepresentadas entre los genes esenciales para las células en las pantallas de pérdida de función basadas en CRISPR monogénicas.


Una pantalla funcional identifica hDRIL1 como un oncogén que rescata la senescencia inducida por RAS

Los fibroblastos primarios responden al H-RAS V12 activado sufriendo un paro prematuro, que se asemeja a la senescencia replicativa 1. Este irreversible 'mecanismo a prueba de fallas' requiere p19 ARF , p53 y el Retinoblastoma (Rb) familia: tras su interrupción, RAS V12 -las células que expresan no experimentan la senescencia y continúan proliferando 1,2,3,4,5,6,7. Del mismo modo, la coexpresión de oncogenes como c-MI C o E1A rescata la senescencia inducida por RAS V12. Para identificar genes novedosos que permitan escapar de la senescencia inducida por RAS V12, diseñamos una pantalla de biblioteca de ADN complementario retroviral imparcial. Informamos sobre la identificación de DRIL1, el ortólogo humano del ratón Brillante y Timbre muerto de Drosophila reguladores transcripcionales. DRIL1 hace que los fibroblastos murinos primarios no respondan a la señalización antiproliferativa inducida por RAS V12 por p19 ARF / p53 / p21 CIP1, así como por p16 INK4a. De esta manera, DRIL1 no solo rescata la senescencia inducida por RAS V12, sino que también hace que estos fibroblastos se vuelvan altamente oncogénicos. Además, DRIL1 inmortaliza fibroblastos de ratón, en presencia de niveles elevados de p16 INK4a. Inmortalización por DRIL1, cuyo producto se une al factor de transcripción E2F1 controlado por pRB (ref. 8), se correlaciona con la inducción de la actividad E2F1. En consecuencia, DRIL1 induce el objetivo E2F1 Ciclina E1, cuya sobreexpresión es suficiente para desencadenar el escape de la senescencia. Por tanto, DRIL1 interrumpe la protección celular contra la proliferación inducida por RAS V12 corriente abajo de la vía p19 ARF / p53.


Referencias

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Abstracto

Las redes moleculares implicadas en la regulación de la replicación, transcripción y latencia del VIH siguen estando definidas de forma incompleta. Para ampliar nuestra comprensión de estas redes, realizamos un cribado de un híbrido de levadura de alto rendimiento imparcial, que identificó 42 factores de transcripción humanos y 85 interacciones proteína-ADN totales con repeticiones terminales largas del VIH-1 y VIH-2. Investigamos un subconjunto de estos factores de transcripción para la actividad transcripcional en modelos de infección basados ​​en células. KLF2 y KLF3 reprimieron la transcripción de VIH-1 y VIH-2 en células T CD4 +, mientras que PLAGL1 activó la transcripción de VIH-2 a través de interacciones directas proteína-ADN. Utilizando modelos computacionales con proteínas que interactúan, aprovechamos los resultados de nuestra pantalla para identificar vías putativas que definen redes transcripcionales intrínsecas. En general, utilizamos una pantalla funcional de alto rendimiento, modelos computacionales y ensayos bioquímicos para identificar y confirmar varios factores de transcripción candidatos y procesos bioquímicos que influyen en la transcripción y latencia del VIH-1 y VIH-2.


Cribado basado en inmunoprecipitación de cromatina para identificar sitios de unión genómica funcional para transactivadores específicos de secuencia

HIGO. 1. Análisis de los niveles de proteína p53, MDM2 y p21 en células MCF-10A y HMEC después del tratamiento con ADR. Se muestra el análisis de transferencia Western de la proteína p53, MDM2 y p21 recolectada de MCF-10A y HMEC primaria que no fueron tratadas (-) o tratadas (+) con ADR (350 nM) durante 8 h. HIGO. 2. Sistema de selección de levadura. Las secuencias de activación candidatas corriente arriba (UAS) recuperadas de ChIP se clonaron en el vector indicador pBM947 que contenía el gen HIS3 bajo el control de un promotor GAL1 basal y un marcador URA1. La biblioteca basada en pBM947 se transformó en una cepa de levadura auxotrófica deficiente en His que contenía el vector pRS314SN, que expresa una p53 humana de tipo salvaje inducible por galactosa y un marcador TRP1. Se cultivaron levaduras que contenían ambos vectores en medio deficiente en histidina que contenía galactosa (SG-Trp-Ura-His) para analizar la capacidad de p53 de unirse al UAS potencial en el vector pBM947 y activar la transcripción del gen HIS3. Se realizó la reproducción en placa de todos los clones en medio deficiente en histidina que contenía glucosa (SD-Trp-Ura-His) para descartar clones positivos falsos. Los clones que crecieron en presencia de glucosa se consideraron falsos positivos, y solo se analizaron más a fondo los clones que crecieron con galactosa, y presumiblemente de una manera dependiente de p53. Un clon que contiene un fragmento del promotor p21 que abarca el sitio 1 se indica como un ejemplo de resultado positivo. HIGO. 3. Análisis de la unión de p53 in vivo a sitios de unión de consenso. Tres conjuntos de células MCF-10A, HMEC y células HK se procesaron de forma idéntica: un conjunto se trató con ADR (350 nM durante 5 h) y formaldehído reticulado (ADR +, XL +), otro conjunto no se trató con ADR y se reticuló con formaldehído (ADR -, XL +), y un conjunto final se trató con ADR y no con formaldehído reticulado (ADR +, XL -). El ADN para las PCR se derivó de inmunoprecipitaciones (IP) específicas de p53 y de ciclina B1 y se amplificó utilizando cebadores que flanquean los elementos de respuesta de p53 en genes que codifican las proteínas indicadas. Las PCR se resolvieron con electroforesis en gel de poliacrilamida y los geles se tiñeron con bromuro de etidio. Las IP específicas de ciclina B1 se incluyeron para evaluar cualquier fragmento de ADN purificado de lisados ​​reticulados de forma inespecífica. Entrada +, entrada genómica entrada -, control de agua. Los resultados de la PCR con cebadores dirigidos a la región codificante de GAPDH sirven como control para el ADN inespecífico IP mediante anticuerpos específicos de p53. HIGO. 4. Análisis comparativo de la unión de p53 a sitios en regiones promotoras de genes diana conocidos y candidatos. En los paneles de la izquierda, se procesaron cuatro conjuntos de HMEC de la siguiente manera: un conjunto se trató con ADR (350 nM durante 5 h), se reticuló con formaldehído y se inmunoprecipitó con un anticuerpo p53 (barras sólidas), otro conjunto se trató con ADR, formaldehído reticulado e inmunoprecipitado con un anticuerpo ciclina B1 (barras abiertas), un tercer conjunto se trató con ADR, no formaldehído reticulado, e inmunoprecipitado con un anticuerpo p53 (barras punteadas) y un conjunto final fue formaldehído reticulado pero no tratados con ADR y luego inmunoprecipitados con un anticuerpo p53 (barras grises). Se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real y cada muestra se normalizó al mismo ADN genómico que se aisló de las células que se reticularon y procesaron del mismo modo, con la excepción de que no se realizó el paso de inmunoprecipitación. Los sitios de unión que se muestran son los que se recuperaron del cribado de la biblioteca (LS), los que se informaron previamente en la literatura (RS) y los que eran sitios de unión potenciales encontrados por análisis de genes utilizando el algoritmo p53MH (PS). La coincidencia de pares de bases del sitio de unión con el consenso de p53 se muestra entre paréntesis. Los resultados, que se muestran como porcentajes de ADN de entrada, son de al menos tres experimentos independientes, con las barras de error que representan las desviaciones estándar. Los paneles de la derecha muestran esquemas de la estructura genómica y la localización de los sitios de unión de p53 conocidos y supuestos analizados. El sombreado de la barra indica la conservación de especies como se indica. Los exones se indican con una E seguida del número de exón en un cuadro abierto o en un cuadro sombreado (que representa el exón terminal). Se muestran las secuencias de los sitios de unión presentes en las regiones analizadas, y entre paréntesis se dan las distancias de los sitios de unión desde el inicio del exón 1. HIGO. 5. Regulación dependiente de p53 de la expresión del gen objetivo candidato representativo. El par isogénico de células HCT116 p53 + / + y p53 - / - se trataron con ADR (350 nM) durante 0, 6, 12 y 24 h, se trataron las células HIp53 (p53) y la línea celular de control del vector correspondiente (Ø) con ponasterona A (10 µM) durante 24 h, y las células HK se infectaron con un adenovirus que expresaba GFP o p53 durante 30 h. El ARN total de las células HCT116 y el ARNm de las células HIp53 y HK se purificó y se sometió a transcripción inversa y se realizó una PCR cuantitativa en tiempo real. Las muestras se normalizaron a GAPDH y los resultados se presentan como cambios en relación con la muestra p53 + / + de 0-h HCT116 p53 + / + (panel izquierdo), las células de control del vector HIp53 tratadas con ponasterona (panel central) o las células HK infectadas. con un adenovirus que expresa GFP (panel derecho). Los resultados son la media de tres experimentos independientes (células MCF-10A y HMEC) o experimentos duplicados (células HK), con barras de error que representan las desviaciones estándar. Tenga en cuenta que el y Los ejes se establecen en 7.0 con las excepciones de los paneles izquierdo y medio para el gen CDKN1A y los paneles izquierdo y derecho para el gen EDN-2.

Contenido

Una especificación funcional no define el funcionamiento interno del sistema propuesto, no incluye la especificación de cómo se implementará la función del sistema. En cambio, se enfoca en lo que varios agentes externos (personas que usan el programa, periféricos de computadora u otras computadoras, por ejemplo) podrían "observar" al interactuar con el sistema.

Un requisito funcional en una especificación funcional podría indicar lo siguiente:

Cuando el usuario hace clic en el botón Aceptar, el cuadro de diálogo se cierra y el foco vuelve a la ventana principal en el estado en el que estaba antes de que se mostrara este cuadro de diálogo.

Tal requisito describe una interacción entre un agente externo (el usuario) y el sistema de software. Cuando el usuario proporciona información al sistema haciendo clic en el botón Aceptar, el programa responde (o debería responder) cerrando la ventana de diálogo que contiene el botón Aceptar.

Propósito Editar

Hay muchos propósitos para las especificaciones funcionales. Uno de los propósitos principales de los proyectos de equipo es lograr algún tipo de consenso de equipo sobre lo que el programa debe lograr antes de realizar el esfuerzo más lento de escribir el código fuente y los casos de prueba, seguido de un período de depuración. Por lo general, dicho consenso se alcanza después de una o más revisiones por parte de las partes interesadas sobre el proyecto en cuestión, después de haber negociado una forma rentable de lograr los requisitos que el software debe cumplir.

  1. Para que los desarrolladores sepan qué construir.
  2. Para que los probadores sepan qué pruebas ejecutar.
  3. Para que las partes interesadas sepan lo que obtienen.

Editar proceso

En el ciclo de vida ordenado de la ingeniería de software industrial (modelo en cascada), la especificación funcional describe qué tiene que ser implementado. El siguiente documento de arquitectura de sistemas describe cómo las funciones se realizarán utilizando un entorno de software elegido. En el desarrollo de sistemas prototípicos no industriales, las especificaciones funcionales generalmente se escriben después o como parte del análisis de requisitos.

Cuando el equipo está de acuerdo en que se alcanza el consenso de la especificación funcional, la especificación funcional generalmente se declara "completa" o "firmada". Después de esto, normalmente el equipo de desarrollo y prueba de software escribe el código fuente y los casos de prueba utilizando la especificación funcional como referencia. Mientras se realizan las pruebas, el comportamiento del programa se compara con el comportamiento esperado según se define en la especificación funcional.

Métodos Editar

Un método popular para escribir un documento de especificación funcional implica dibujar o renderizar ya sea marcos de alambre simples o capturas de pantalla de la interfaz de usuario precisas y diseñadas gráficamente. Una vez que se haya completado esto, y los ejemplos de pantalla hayan sido aprobados por todas las partes interesadas, los elementos gráficos se pueden numerar y se pueden agregar instrucciones escritas para cada número en el ejemplo de pantalla. Por ejemplo, una pantalla de inicio de sesión puede tener el campo de nombre de usuario etiquetado como '1' y el campo de contraseña etiquetado como '2', y luego cada número se puede declarar por escrito, para que lo utilicen los ingenieros de software y más tarde con fines de prueba beta para garantizar que la funcionalidad sea la adecuada. destinado a. El beneficio de este método es que se pueden adjuntar innumerables detalles adicionales a los ejemplos de pantalla.


Agradecimientos

Agradecemos a Hans Teunissen y Elzo de Wit por su ayuda en el experimento 3C y a todos los miembros del laboratorio Agami por su ayuda técnica y discusiones. Agradecemos a NKI Genomics Core Facility por secuenciar en profundidad nuestras muestras.

Fondos

Este trabajo fue apoyado por ERC-AdG enhReg (322493 a RA), ERC-ITN RNA TRAIN (607720 a RA), China Scholarship Council (CSC) (a LL), The Human Frontier Science Program LT000640 / 2013 (a APU) y la Organización Holandesa de Investigación NWO-TOP 91216002 (a RA). RE cuenta con el apoyo de la Asociación Israelí del Cáncer (ICA), con la generosa ayuda de los amigos de la ICA de los Países Bajos y del Fondo de becas de investigación Marguerite Stolz. ZM fue apoyado en parte por la beca Gad, Nava y Shye Shtacher. RE es miembro de la facultad del Centro Edmond J. Safra de Bioinformática de la Universidad de Tel Aviv.

Disponibilidad de datos y materiales

Los datos de RNA-seq están disponibles en el número de acceso de GEO DB GSE112458 [50]. Los datos de GRO-seq están disponibles en el número de acceso de GEO DB GSE109290 [51].


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Anatomía de una molécula: ¿Qué hace que remdesivir sea único?

A fines de enero, la Organización Mundial de la Salud convocó a expertos para discutir terapias experimentales para pacientes con el coronavirus emergente sin nombre, sin vacuna y sin tratamiento. El panel informó que "entre las diferentes opciones terapéuticas, remdesivir fue considerado el candidato más prometedor".

En unas semanas, se estaba llevando a cabo un ensayo clínico del compuesto en China. Se esperan resultados en abril, mientras tanto, el brote de SARS-nCoV-2, el virus que causa COVID-19, se ha convertido en una pandemia mundial.

Remdesivir es un análogo de nucleósido, una de las clases más antiguas de medicamentos antivirales. Actúa bloqueando la ARN polimerasa que los coronavirus y los virus ARN relacionados necesitan para replicar sus genomas y proliferar en el organismo huésped.

La molécula se sintetizó originalmente como parte de un cribado de inhibidores de la ARN polimerasa del virus de la hepatitis C. Sus inventores en Gilead Sciences decidieron avanzar con un compuesto análogo de nucleósido diferente para tratar la hepatitis C. Pero las ARN polimerasas dependientes de ARN se conservan entre muchos virus. Los experimentos in vitro, en cultivos celulares y en modelos animales han demostrado que el remdesivir tiene una actividad de amplio espectro contra los virus de ARN, incluidos los filovirus (como el que causa el Ébola) y los coronavirus.

Remdesivir se asemeja a la adenosina de base de ARN, que se muestra aquí como un monofosfato.

El compuesto y el ATP tienen algunas diferencias importantes, pero algunas características son muy similares. ASBMB Today habló con la química medicinal Katherine Seley & ndashRadtke de la Universidad de Maryland, condado de Baltimore, y el virólogo estructural Craig Cameron de la Universidad de Carolina del Norte, Chapel Hill, sobre lo que hace que la molécula sea interesante. Haga clic en una función marcada en azul para leer sus comentarios.

3 y rsquo grupo hidroxi

Las diferentes clases de análogos de nucleósidos / nucleótidos tienen diferentes efectos sobre las polimerasas. El remdesivir pertenece a una clase denominada terminadores de cadena no vinculantes porque, en teoría, debería ser posible agregar más nucleótidos a una hebra de ARN después de que se haya agregado remdesivir debido a la presencia del grupo hidroxilo en el carbono 3 del azúcar.

"Ese grupo hidroxi es lo que se requiere para la síntesis continua de ácido nucleico, ya sea ARN o ADN", dijo el virólogo Craig Cameron, profesor de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, que estudia las interacciones entre los análogos de nucleósidos y las polimerasas virales.

Investigaciones recientes sugieren que cuando se mezcla con ARN polimerasas de coronavirus o flavivirus in vitro, el remdesivir no termina la síntesis de una nueva cadena de ARN de inmediato. En cambio, dijo Cameron, "se necesitan algunos ciclos de adición de nucleótidos antes de que pueda ver el efecto de terminación".

Esos nucleótidos adicionales pueden ayudar a proteger al remdesivir de las enzimas correctoras de coronavirus que se sabe que eliminan los análogos de nucleótidos no naturales.

Emparejamiento de bases con uracilo

En la adenosina en el ARN bicatenario, esta cara de la molécula participa en el apareamiento de bases con el uracilo. Los dos nitrógenos actúan como donador y aceptor de protones, respectivamente, para enlaces de hidrógeno a átomos en la base de uracilo.

Los químicos piensan que el remdesivir, al presentar una cara de unión muy similar, se incorpora a una cadena de ARN en crecimiento mediante polimerasas virales.

Enlace C-nucleósido

El enlace entre la ribosa y la base se llama enlace glicosídico. Por lo general, conecta el carbono 1 & rsquo en el anillo de ribosa con un nitrógeno en la base. Pero en remdesivir (y algunos otros análogos de nucleótidos) el azúcar y la nucleobase están conectados por un enlace entre dos carbonos.

"Definitivamente proporciona una estabilidad mucho mayor (contra) las nucleasas y otras enzimas que pueden escindir la nucleobase del azúcar", dijo Katherine Seley-Radtke, química medicinal de la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore, que trabaja en el diseño y síntesis de nucleósidos antivirales. análogos. Con un nucleósido C, "debería romper un enlace carbono-carbono", mientras que en un nucleósido normal debería romper un enlace hemiaminal, que en realidad es bastante inestable. Entonces, tener ese enlace carbono-carbono es una gran ventaja. & Rdquo

1 & rsquo grupo ciano

Pregúntele a un grupo de químicos qué les llama la atención sobre el remdesivir, y la mayoría comenzará con esta característica dramática. La sustitución en este carbono es inusual y probablemente solo sea posible debido a la fuerza del enlace C-nucleósido.

Según un artículo del Journal of Medicinal Chemistry, el grupo ciano se agregó inicialmente porque una molécula precursora, un inhibidor muy eficaz de las ARN polimerasas virales, también bloqueaba la ARN polimerasa mitocondrial en ratones. Para fabricar una molécula sin esos efectos secundarios tóxicos, los químicos de Gilead probaron una serie de sustituciones en el carbono 1 & rsquo. El compuesto con el grupo ciano funcionó mejor: todavía bloqueaba la polimerasa de la hepatitis C, pero ya no era incorporado por las polimerasas de la célula huésped.

& ldquoPuedes predecir la actividad. Tienes que hacerlo y probarlo ”, dijo Seley-Radtke. & ldquoPero incluso los cambios pequeños pueden tener consecuencias asombrosas. & rdquo

Fosfato

"¿Ves todos esos restos flotantes y desechos saliendo del hidroxilo 5 & rsquo?", dijo Katherine Seley-Radtke. Entre los químicos medicinales, este tipo de grupo protector se conoce casualmente como & ldquoa McGuigan protide. Diseñado por el químico médico Chris McGuigan en la década de 1990, este tipo de grupo protector y sus variaciones se utilizan ampliamente para administrar análogos de nucleótidos a las células.

"Es un sistema brillante, porque logra dos cosas", dijo Seley-Radtke. & ldquoNo. 1, un problema con los nucleósidos es que son polares y sus fosfatos son aún más polares. & Rdquo Enmascarar los grupos fosfato altamente negativos con ésteres o amidas reduce la polaridad general de la molécula y rsquos, lo que le permite cruzar la membrana plasmática hacia las células.

En segundo lugar, para ser reconocido por las polimerasas, el análogo debe parecerse a un nucleótido trifosfato normal, lo que significa que debe fosforilarse.

&ldquoThe first phosphorylation, either by cellular or viral kinases, is oftentimes very difficult,&rdquo Seley-Radtke said. &ldquoA lot of those kinases are very, very picky in terms of recognition.&rdquo By arriving in the cell with its first phosphate already in tow, remdesivir and related nucleotide analogs skip that rate-limiting step. After the protecting groups are cleaved, the nucleotide analog is a reasonable substrate for later nucletodie kinases.