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9.12C: Virus oncogénicos de ARN - Biología

9.12C: Virus oncogénicos de ARN - Biología


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Se estima que el 15% de todos los cánceres humanos en todo el mundo pueden atribuirse a virus.

Objetivos de aprendizaje

  • Clasifica los virus con propiedades oncogénicas.

Puntos clave

  • Se ha demostrado que tanto los virus de ADN como los de ARN pueden causar cáncer en humanos.
  • El virus linfotrófico T humano tipo 1 y los virus de la hepatitis C son los dos virus de ARN que contribuyen a los cánceres humanos.
  • El virus de la hepatitis C es un virus de ARN envuelto capaz de causar hepatitis aguda y crónica en humanos al infectar las células del hígado. Se estima que el 3% de la población mundial son portadores. La infección crónica por el virus de la hepatitis C produce cirrosis, que a su vez puede provocar cáncer de hígado.

Términos clave

  • oncogénico: Tiende a provocar la formación de tumores.
  • hepatocelular: Perteneciente o relativo a las células del hígado

Hay dos clases de virus del cáncer: virus de ADN y de ARN. Varios virus se han relacionado con ciertos tipos de cáncer en humanos. Estos virus tienen diferentes formas de reproducción y representan varias familias de virus diferentes. Específicamente, los virus de ARN tienen ARN como su material genético y pueden ser ARN monocatenario (ssRNA) o bicatenario (dsRNA). Los virus de ARN se clasifican según el sistema de clasificación de Baltimore y no tienen en cuenta los virus con intermediarios de ADN en su ciclo de vida. Los virus que contienen ARN para su material genético pero que incluyen intermedios de ADN en su ciclo de vida se denominan “retrovirus”. “Existen numerosos virus oncogénicos de ARN que se han relacionado con varios tipos de cáncer. Estos diversos virus oncogénicos incluyen:

1. El virus linfotrófico T humano tipo 1 (HTLV-I), un retrovirus, se ha relacionado con la leucemia de células T. 2. El virus de la hepatitis C se ha relacionado con el cáncer de hígado en personas con infecciones crónicas.

2. Los virus de la hepatitis incluyen la hepatitis B y la hepatitis C se ha relacionado con el carcinoma hepatocelular.

3. Los virus del papiloma humano (VPH) se han relacionado con el cáncer de cuello uterino, ano, pene, vagina / vulva y algunos cánceres de cabeza y cuello.

4. El virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (HHV-8) se ha relacionado con el sarcoma de Kaposi y el linfoma de derrame primario.

5. El virus de Epstein-Barr (VEB) se ha relacionado con el linfoma de Burkitt, el linfoma de Hodgkin, la enfermedad linfoproliferativa postrasplante y el carcinoma nasofaríngeo.

Retrovirus de ARN

Los retrovirus son diferentes de los virus tumorales de ADN en que su genoma es ARN, pero son similares a muchos virus tumorales de ADN en que el genoma está integrado en el genoma del huésped. Dado que el ARN constituye el genoma de la partícula del virus maduro, debe copiarse al ADN antes de la integración en el cromosoma de la célula huésped. Este estilo de vida va en contra del dogma central de la biología molecular en el que ese ADN se copia en ARN. La envoltura externa proviene de la membrana plasmática de la célula huésped. Las proteínas de la cubierta (antígenos de superficie) están codificadas por el gen env (envoltura) y están glicosiladas. Se produce un producto génico primario, pero este se escinde de modo que haya más de una glicoproteína de superficie en el virus maduro (la escisión se realiza mediante la enzima del huésped en el aparato de Golgi). La proteína primaria (antes de la escisión) se produce en los ribosomas unidos al retículo endoplásmico y es una proteína transmembrana (tipo 1). Dentro de la membrana hay una cápside icosaédrica que contiene proteínas codificadas por el gen gag (AntiGen específico de grupo). Las proteínas codificadas por Gag también recubren el ARN genómico. Una vez más, hay un producto genético primario. Esta es escindida por una proteasa codificada por virus (del gen pol). Hay dos moléculas de ARN genómico por partícula de virus con una tapa 5 'y una secuencia poli A de 3'. Por tanto, el virus es diploide. El ARN tiene sentido positivo (el mismo sentido que el ARNm). Aproximadamente 10 copias de transcriptasa inversa están presentes dentro del virus maduro, estas están codificadas por el gen pol. El gen Pol codifica varias funciones (de nuevo, como ocurre con gag y env, se produce una poliproteína que luego se corta).


Un virus oncogénico promueve la supervivencia celular y la transformación celular al suprimir la glucólisis

La glucólisis aeróbica es esencial para apoyar el rápido crecimiento de una variedad de cánceres. Sin embargo, su papel en la supervivencia de las células cancerosas en condiciones de estrés no está claro. Anteriormente hemos informado de un modelo eficaz de transformación celular inducida por el virus del herpes gammaherpes de Kaposi de las células madre mesenquimales primarias de rata. Las células transformadas por KSHV inducen eficazmente tumores en ratones desnudos con características patológicas que recuerdan a los tumores del sarcoma de Kaposi. Aquí, informamos que KSHV promueve la supervivencia celular y la transformación celular al suprimir la glucólisis aeróbica y la fosforilación oxidativa bajo estrés nutricional. Específicamente, los microARN de KSHV y vFLIP suprimen la glucólisis activando la vía NF-κB para regular a la baja los transportadores de glucosa GLUT1 y GLUT3. Mientras que la sobreexpresión de los transportadores rescata la actividad glucolítica, induce la apoptosis y reduce la eficiencia de formación de colonias en softagar bajo privación de glucosa. Mecánicamente, GLUT1 y GLUT3 inhiben la activación constitutiva de las vías de pro-supervivencia de AKT y NF-κB. Sorprendentemente, GLUT1 y GLUT3 están significativamente regulados a la baja en células infectadas con KSHV en tumores de KS humanos. Además, hemos detectado niveles reducidos de glucólisis aeróbica en varias líneas celulares de linfoma de efusión primaria infectadas por KSHV en comparación con una línea celular de linfoma de Burkitt BJAB, y la infección por KSHV de las células BJAB redujo la glucólisis aeróbica. Estos resultados revelan un mecanismo novedoso por el cual un virus oncogénico regula una vía metabólica clave para adaptarse al estrés en el microambiente tumoral, e ilustran la importancia de ajustar las vías metabólicas para mantener la proliferación y supervivencia de las células cancerosas, particularmente en condiciones de estrés.


Luc Montagnier

Nací el 18 de agosto de 1932 en Chabris, un & # 8220bourg & # 8221, más grande que un pueblo pero más pequeño que una ciudad, ubicado en Berry al sur del Valle del Loira. Esta era, y sigue siendo, una región agrícola con algunos productos de renombre como el conejo galés, los quesos de cabra y el espárrago blanco. Era el lugar donde se había criado mi madre pero, de hecho, nunca viví allí.

Por parte de mi padre, sus padres procedían de Auvernia, una provincia en el centro de Francia, formada por ricas llanuras y antiguos volcanes, este último probablemente sea el origen de mi apellido: Montagnier, el hombre que vive en las montañas.

En su juventud, mi padre había contraído una enfermedad terrible: artritis estreptocócica, que terminaba en lesiones irreversibles en las válvulas aórticas. Por lo tanto, fue declarado no apto para el servicio militar y tuvo que buscar un trabajo sedentario: se convirtió en contador y se destacó en esta profesión, que implicaba, en ese momento, un trabajo mayoritariamente manuscrito. Comenzó a trabajar en la zona de Poitiers y luego se trasladó un poco más al norte a Châtellerault, una pequeña ciudad entre Tours y Poitiers.

Como hijo único, fui querido por mi madre, ama de casa, pero dos eventos dominaron este período anterior a la guerra, de los cuales guardo un vivo recuerdo:

Fui gravemente herido por un coche de alta velocidad al cruzar una carretera principal: múltiples heridas de las que conservo algunas cicatrices visibles. Después de dos días en coma, emergí como si hubiera nacido de nuevo, a la edad de 5 años (Figura 1).

Figura 1. Luc Montagnier a la edad de 5 años.

& # 8230 y dos años después llegó la declaración de guerra en 1939, mientras toda la familia estaba cosechando uvas en los viñedos de mi madre & # 8217s hermano. Todavía recuerdo las imágenes en un periódico de las ruinas de Varsovia después de un bombardeo de aviones alemanes.

Y luego, en 1940, vino la guerra & # 8220real & # 8221: la invasión alemana, mis padres y yo salimos de su casa (cerca de una peligrosa estación de tren), huimos por las carreteras en un pequeño coche y finalmente nos expusimos más a los alemanes. bombardeo durante este & # 8220exodus & # 8221 que si nos hubiéramos quedado en casa.

El primer año de ocupación alemana fue terrible, ya que no teníamos reservas de alimentos y la mayor parte del tiempo nos moríamos de hambre. ¡Yo era un niño bastante endeble y durante los cuatro años de la guerra no gané ni un gramo! ¡El & # 8220ersatz & # 8221 no estimuló mi apetito, cuando estaba soñando con chocolate y naranjas! Mi padre tenía enterocolitis crónica y, peor aún, a mi abuelo (su padre) le diagnosticaron cáncer de recto. Murió en 1947 después de un terrible sufrimiento y cada vez que lo visitaba, podía ver la progresión inexorable de la enfermedad. Esto me afectó tanto que probablemente sea una de las razones por las que más tarde decidí estudiar medicina y empezar a investigar sobre el cáncer.

En junio de 1944, nuestra casa (tan cerca del ferrocarril) fue parcialmente destruida, esta vez por un bombardeo aliado. Guardo un sentimiento mixto de este año de la liberación de Francia. Fue un gran alivio pero no pude olvidar también la visión de tantos muertos, civiles y soldados, y las imágenes de deportados flacos liberados de los campos de concentración. Odiaré las guerras y sus atrocidades por el resto de mi vida.

En la escuela secundaria me fue bien, generalmente por delante de mis compañeros de clase. Fue entonces cuando sentí curiosidad por el conocimiento científico, habiendo dejado atrás mi creencia católica religiosa.

Siguiendo el ejemplo de mi padre, que en sus días de ocio jugaba con baterías eléctricas, instalé un laboratorio de química en el sótano de la nueva casa que fue requisado para acomodarnos. Allí, produje con entusiasmo gas hidrógeno, aldehídos aromáticos y compuestos nitro (¡no nitroglicerina!) Que tenían la desafortunada costumbre de explotar en mi cara.

Me encantó leer, en libros popularizados, el impresionante progreso de la física, especialmente la física atómica. Siendo bueno en física y química, pero no tan bueno en matemáticas, decidí no prepararme para competir por las & # 8220Grandes Ecoles & # 8221, sino registrarme tanto en la Facultad de Medicina como en la Facultad de Ciencias de Poitiers. Mi objetivo era, de hecho, iniciar una carrera de investigación en biología humana, pero no existía tal especialidad en Poitiers, ni en Medicina ni en Ciencias. Dado que tanto la Facultad como la Escuela estaban a poca distancia, podía pasar la mañana en el hospital y la tarde asistiendo a cursos de botánica, zoología y geología, que eran las principales disciplinas de la carrera de Ciencias.

Afortunadamente, el nuevo profesor de botánica, Pierre Gavaudan, era un profesor muy atípico en el sentido de que sus intereses científicos iban mucho más allá de la clasificación de las plantas. De hecho, le debo por haberme abierto una gran ventana sobre lo que fue el comienzo de una nueva biología, la doble hélice del ADN, la in vitro síntesis de proteínas por ribosomas y estructura de virus.

Al mismo tiempo, estaba instalando en casa un dispositivo que combinaba una cámara de video time-lapse y un microscopio, gracias a un regalo de mi padre. Esto me permitió hacer mi primer trabajo de investigación. Estaba estudiando un fenómeno conocido desde 1908 como fototaxia de los cloroplastos: la propiedad de algunas algas que viven en la superficie de los estanques de orientar su gran cloroplasto único de acuerdo con la intensidad de la luz si la luz era demasiado intensa, el cloroplasto giraba dentro del tubular. celda para presentar su borde. En luz oscura o más débil, el cloroplasto, una placa plana, expone su superficie más grande. El fenómeno tardó unos minutos, que pudieron analizarse mediante cinematografía time-lapse. Usando diferentes filtros de vidrio, pude demostrar que no era la longitud de onda absorbida por la clorofila (luz roja) la que regulaba la orientación de los cloroplastos, sino que indirectamente algunos pigmentos amarillentos absorbían la luz azul. Me sentí muy orgulloso, a los 21 años, de defender este trabajo como una pequeña tesis en la Facultad de Ciencias de Poitiers. Mi mentor, Pierre Gavaudan, me pidió que investigara también un tema basado en la literatura: las formas L de las bacterias. Esto me permitió hacer mi primera incursión, no la última, en el mundo de la filtración de bacterias. Solo pude encontrar las referencias sobre este controvertido tema en la biblioteca del Institut Pasteur de París. De hecho, este fue el momento en que dejé Poitiers hacia París, donde pude completar mis estudios de medicina y explorar algunos aspectos de la biología más cercanos al ser humano, en particular la neurofisiología, la virología y la oncología.

Habiendo sido contratado como asistente en la Sorbona a la edad de 23 años, comencé a aprender tecnologías anticuadas derivadas del trabajo de Alexis Carrel en cultivos de corazón de embriones de pollo, así como en líneas de células humanas en monocapas. Aunque mi investigación no fue para nada productiva, conservo de este período una sólida experiencia en tecnologías pasteurianas para trabajar en condiciones perfectamente estériles sin el uso de antibióticos.

En 1957, la primera descripción del ARN viral infeccioso del virus del mosaico del tabaco por Fraenkel-Conrat y Gierer y Schramm determinó mi vocación: convertirme en virólogo utilizando el enfoque moderno de la biología molecular.

Comencé con el virus de la fiebre aftosa y luego, en el laboratorio Kingsley Sanders & # 8217 en Carshalton cerca de Londres, tuve el orgullo de identificar por primera vez un ARN de doble hebra infeccioso de células infectadas con el virus de la encefalomiocarditis murina, un pequeño virus de ARN trenzado. Esto demostró por primera vez que el ARN podía replicarse como el ADN al hacer una cadena complementaria de pares de bases.

Para perfeccionar mi conocimiento de los virus oncogénicos, me mudé de Carshalton a Glasgow, donde se había inaugurado recientemente un nuevo Instituto de Virología, dirigido por un virólogo destacado, Michael Stocker, y donde estaban muchos visitantes de alto rango, entre ellos Renato Dulbecco. pasar años sabáticos.

Trabajando en un pequeño virus de ADN oncogénico, polioma, pude mostrar allí, con I. Macpherson, una nueva propiedad de las células transformadas, la de crecer en agar blando. Con esta técnica, fue fácil detectar la capacidad de transformación del virus del polioma y su ADN. Demostramos que el ADN desnudo por sí solo portaba todo el potencial oncogénico del virus. Esto ahora parece bastante obvio, pero no lo era en ese momento.

De regreso a Francia en el Institut Curie, extendí este hallazgo a varias células cancerosas, transformadas o no por virus oncogénicos de ARN o ADN. Sin embargo, esta propiedad me permitió distinguir algunos in vitro pasos en el proceso de transformación, que se correlacionaron con algunas modificaciones de la membrana plasmática y de la capa de carbohidratos que la rodea.

En ese momento quedaba un gran misterio: el de la replicación de los virus ARN oncogénicos, ahora conocidos como retrovirus. Howard Temin (Figura 2) había propuesto la hipótesis de un intermedio de ADN, pero se podrían considerar otras posibilidades. Yo mismo intenté encontrar un ARN de doble hebra específico del virus del sarcoma de Rous, un virus capaz de infectar y transformar células de embriones de pollo. De hecho, aislé secuencias de ARN de doble hebra, ¡pero eran de origen celular y existían al mismo nivel en las células no infectadas! Con Louise Harel, demostré más tarde que este ARN provenía en parte de secuencias repetitivas de ADN. En retrospectiva, podría representar al menos en parte los ARN interferentes recientemente identificados involucrados en el control negativo de la traducción del ARN mensajero.

Figura 2. Recibiendo una placa de premio de la Sociedad Estadounidense de Patología de manos de Howard Temin & # 8217 en 1985.

En 1969-70, el aislamiento de una ARN polimerasa asociada con las partículas virales del virus de la estomatitis vesicular llevó a la idea de que quizás una enzima clave también estaba asociada con los virus ARN oncogénicos. De hecho, Howard Temin y Mizutani, e independientemente David Baltimore, descubrieron en 1970 una enzima específica asociada con el virus del sarcoma de Rous (RSV), la transcriptasa inversa (RT), capaz de transcribir inversamente el ARN viral en ADN.

Aproximadamente al mismo tiempo, Hill y Hillova en Villejuif, Francia, demostraron que el ADN extraído de las células transformadas por RSV era infeccioso y transportaba la información genética del ARN viral, lo que confirma que la enzima funcionaba fielmente en las células infectadas.

Yo mismo, con P. Vigier, confirmé y amplié este descubrimiento mostrando que el ADN infeccioso estaba asociado con el ADN cromosómico de las células, mostrando la integración del ADN proviral, como postuló anteriormente Temin.

El trabajo sobre el VSR del pollo se extendió a virus similares en mamíferos, por lo que muchos investigadores en ese momento creían que la actividad de RT era una herramienta nueva y altamente sensible para detectar virus similares en la leucemia y el cáncer humanos. Esto fue estimulado por el programa de virus-cáncer, financiado generosamente, lanzado por los Institutos Nacionales de Salud de Estados Unidos. Desafortunadamente, la búsqueda de retrovirus humanos fue básicamente infructuosa, pero condujo a un importante trabajo básico sobre la biología molecular de los retrovirus animales.

En 1972, Jacques Monod, entonces director del Institut Pasteur, me pidió que creara una unidad de investigación en el recién creado Departamento de Virología del Instituto. Acepté, y este nuevo laboratorio me permitió desarrollar nuevas vías de investigación dentro del tema general de Oncología Viral, cuyo objetivo final sigue siendo la detección de virus involucrados en cánceres humanos.

Por lo tanto, me interesé en el mecanismo de acción del interferón y su papel en su expresión de retrovirus. Entré en este campo después de haber demostrado la actividad biológica del ARN mensajero del interferón en colaboración con dos expertos de renombre mundial en el campo, Edward y Jacqueline De Maeyer.

A partir de 1973, Ara Hovanessian y sus colaboradores se unieron a mi unidad y aportaron una nueva dimensión: el complejo mecanismo bioquímico que sustenta la actividad antiviral de este notable grupo de proteínas celulares.

En 1975, otros dos investigadores se unieron a mi unidad y aportaron su experiencia en retrovirus murinos: J. C. Chermann y su colaboradora, Françoise Barré-Sinoussi (Figura 3). Este último dominó particularmente la detección de retrovirus por su actividad RT. Los convencí de que participaran en un estudio conjunto dentro de la unidad para buscar nuevamente retrovirus en cánceres humanos. Comenzamos en 1977 con muestras de sangre provenientes de diferentes hospitales de París y muestras de biopsia.

Figura 3. Descubridores del VIH en el parque del anexo del Institut Pasteur en Garches, cerca de París, durante un descanso de una & # 8220100 reunión de guardias & # 8221 en 1987. De izquierda a derecha: Jonas Salk, Jean-Claude Gluckman, Jean-Claude Chermann, Luc Montagnier, Robert Gallo, Françoise Barré-Sinoussi, Willy Rozenbaum, Charles Mérieux.

Dos avances realizados en otros laboratorios impulsaron esta búsqueda:

En Villejuif, Francia, Ion Gresser había preparado un potente antisuero que neutraliza cualquier molécula de interferón alfa endógeno producido por células individuales.Este interferón, nos dimos cuenta, fue producido por células de ratón inducidas para expresar algunos de sus retrovirus endógenos. Su bloqueo por el antisuero aumentó hasta 50 veces la producción de retrovirus endógenos en el medio de cultivo. Podríamos concluir que, a pesar de que los retrovirus endógenos se han integrado en el genoma de los vertebrados durante millones de años, su expresión sigue estando controlada por el sistema de interferón, como el de los virus exógenos.

Aproximadamente en el mismo período, el descubrimiento por Denis Morgan y Frank Ruscetti en el laboratorio del Dr. Gallo de un factor de crecimiento que permite la in vitro la multiplicación de linfocitos T humanos (TCGF, ​​entonces denominada interleucina 2, II2) hizo posible la propagación de linfocitos T en cultivos sostenidos.

En ese momento sabíamos que algunos retrovirus implicados en la formación de tumores mamarios de ratón (MMTV) no solo podían expresarse en las células tumorales sino también en los linfocitos circulantes.

Aprovechando estos dos avances, iniciamos una búsqueda de retrovirus en cánceres humanos. Usando suero anti-interferón e Il2, nos enfocamos particularmente en los cultivos de linfocitos T de pacientes con cáncer de mama.

De hecho, en 1980, pudimos detectar una secuencia de ADN cercana a ese MMTV, no solo en las células de un cáncer de mama inflamatorio (de una mujer del norte de África), sino también en sus linfocitos T cultivados. Un segundo paciente mostró resultados similares.

Desafortunadamente, las herramientas moleculares que teníamos en ese momento no podían decirnos si estábamos tratando con secuencias retrovirales endógenas o con un virus exógeno. Actualmente, teniendo acceso a tecnologías más potentes, planeo reiniciar estos estudios.

Pero en 1983, el mismo enfoque, el uso de suero anti-interferón y el uso de cultivos a largo plazo de linfocitos T facilitaron enormemente el aislamiento del VIH.

Mi participación en el sida comenzó en 1982, cuando circuló la información de que un agente transmisible, posiblemente un virus, podría estar en el origen de esta nueva y misteriosa enfermedad. En ese momento solo había unos pocos casos en Francia, pero atrajeron el interés de un grupo de jóvenes clínicos e inmunólogos. Buscaban virólogos, especialmente retrovirólogos, ya que una hipótesis probable era que el HTLV, el único retrovirus humano conocido hasta ahora, descrito recientemente por R. C. Gallo, podría estar involucrado. Los retrovirus que causan leucemia en roedores a menudo también causan un síndrome de emaciación, que podría ser el resultado de una inmunodepresión secundaria. Este fue también el caso de los pacientes que padecían leucemia inducida por HTLV.

Una integrante del grupo de trabajo, Françoise Brun-Vézinet, era una ex alumna del curso de virología que entonces dirigía. Me llamó para organizar la búsqueda del presunto retrovirus de un paciente que presentaba un signo temprano de la enfermedad, linfodenopatía. El paciente era un joven gay que había estado viajando a los Estados Unidos y que consultaba al Dr. Willy Rozenbaum, uno de los líderes del grupo de trabajo, por una inflamación de los ganglios linfáticos del cuello.

El razonamiento fue que si encontráramos un virus en esta etapa temprana de la enfermedad, podría ser más una causa que una consecuencia de la depresión inmunológica.

Otro incentivo para iniciar esta investigación fue una solicitud de los productores de la vacuna contra el virus de la hepatitis B en la filial industrial del Institut Pasteur. Estaban usando plasmas de donantes de sangre estadounidenses y estaban preocupados por el riesgo de transmisión del agente del SIDA a través de su procedimiento de purificación de antígenos virales.

La biopsia de los ganglios linfáticos llegó el 3 de enero de 1983, fecha que recuerdo bien porque también era el primer día del curso de virología en el Institut Pasteur, que tenía que presentar. Solo pude diseccionar la pequeña pieza dura al final del día. Disocié los linfocitos con un homogeneizador de vidrio Dounce y comencé su estimulación en cultivo con un mitógeno bacteriano, la Proteína A, conocida como activador de los linfocitos B y T, ya que no sabía qué fracción de linfocitos podía producir el virus putativo. Tres días después, agregué el factor de crecimiento de células T que había obtenido de un colega que trabajaba en el laboratorio de Jean Dausset.

Las células T crecieron bien. Como se estableció previamente en un protocolo para la búsqueda de retrovirus en cánceres humanos, se decidió con mis asociados, Françoise Barré-Sinoussi y Jean-Claude Chermann, medir la actividad de RT en el medio de cultivo cada 3 días. El día 15, Françoise me mostró un indicio de positividad (incorporación de timidina radiactiva en el ADN polimérico), que se confirmó la semana siguiente.

Teníamos evidencia de un retrovirus, pero esto fue solo el comienzo de una serie de preguntas:
• ¿Estuvo cerca de HTLV o no?
• ¿Fue un virus pasajero o, por el contrario, la verdadera causa de la enfermedad?

Para responder a estas preguntas básicas, tuvimos que caracterizar el virus bioquímica e inmunológicamente, y para hacerlo, tuvimos que propagarlo en cantidades suficientes. Afortunadamente, el virus podría propagarse fácilmente en linfocitos T activados de donantes de sangre adultos. No se observó ningún efecto citopático con este primer aislado, pero a diferencia de los cultivos infectados con HTLV, no pudieron emerger líneas celulares transformadas inmortalizadas de los cultivos, que siempre morían después de 3-4 semanas como ocurre con los linfocitos normales.

Por el contrario, los aislamientos posteriores que hice a partir del cultivo de linfocitos de pacientes enfermos con SIDA fueron citopáticos para el cultivo de linfocitos T y, como descubrimos más tarde, podrían cultivarse en mayores cantidades en líneas de células tumorales derivadas de leucemia.

Poco después del aislamiento del virus, mis compañeros de trabajo y yo pudimos demostrar que no estaba inmunológicamente relacionado con el HTLV y, en microscopía electrónica, era muy diferente de las partículas virales del HTLV. De hecho, tan pronto como en junio de 1983, noté la cuasi-identidad de nuestro virus con las imágenes publicadas de microscopía electrónica del virus visna en ovejas, el virus de la anemia infecciosa en caballos y el virus linfocítico bovino: era un retrolentivirus, un sub -familia de virus que causan enfermedades de larga duración en animales sin inmunodeficiencia.

Esto indicaba claramente que estábamos tratando con un virus muy diferente al HTLV, y mi tarea ahora era organizar un equipo de investigadores para acumular evidencia de que este nuevo virus era realmente la causa del SIDA.

Fue un período emocionante, ya que todos los sábados por la mañana, cuando teníamos una reunión en mi oficina, mis asociados traían nuevos datos que favorecían el papel causal del virus. Los aislamientos virales se denominaron LAV, por el virus asociado a la linfadenopatía, cuando se aisló de pacientes que presentaban inflamación de los ganglios linfáticos, un signo frecuente de la fase inicial de la infección. Los aislamientos hechos de pacientes con SIDA en toda regla se denominaron virus asociados a la inmunodeficiencia (IDAV). Este último generalmente creció mejor en cultivo de linfocitos T e indujo la formación de grandes sincitias, resultado de la fusión entre varias células infectadas. Algunos de ellos, descubrimos más tarde, también podrían multiplicarse en líneas celulares continuas de origen de células B o T. Esta última propiedad facilitó enormemente la producción masiva del virus para uso comercial.

En septiembre de 1983, pude hacer una presentación sintetizada de todos nuestros datos que favorecían un vínculo causal entre el virus y la enfermedad en una reunión sobre el HTLV organizada por L. Gross y R. Gallo en Cold Spring Harbor.

Esta presentación fue recibida con escepticismo por una pequeña audiencia (fue una sesión nocturna) y la teoría del HTLV aún prevaleció. Mentalmente, la mayoría de los asistentes no estaban preparados para aceptar la idea de una segunda familia de retrovirus (lentiretrovirus) que existía en los humanos y causaba inmunodeficiencia, ¡y no tenía contraparte en los animales!

Esta situación no es infrecuente en la ciencia, ya que los nuevos descubrimientos suelen suscitar controversia. El único problema es que se trataba de una cuestión de vida o muerte para las personas que habían recibido transfusiones de sangre y los hemofílicos, ya que un análisis de sangre serológico con nuestro antígeno viral ya funcionaba a escala de laboratorio, pero estaba pendiente de desarrollo industrial y comercial.

Esto se produjo en 1985, después de que otros dos equipos de investigadores, primero el del Dr. Gallo en el NIH a principios de 1984 y el de Jay Levy en San Francisco, confirmaron y ampliaron nuestros hallazgos. En particular, el Dr. Gallo y sus colaboradores dieron más fuerza a la correlación entre el virus y la enfermedad, mejoraron la detección de la respuesta de anticuerpos y pudieron hacer crecer varias cepas virales, incluida la nuestra, en líneas de células T de origen canceroso. Mientras tanto, mis compañeros de trabajo mostraron el tropismo del virus por las células CD4T e identificaron la molécula de superficie CD4 como el principal receptor del virus.

El resto de la historia se describe en el próximo capítulo. Solo me gustaría ilustrar cómo descubrí lo que creo que son dos fenómenos importantes para explicar la destrucción del sistema inmunológico inducida por el VIH.

Durante la fase latente de la infección, no se encuentra ningún virus en la sangre. Se localiza principalmente en los linfocitos de los tejidos linfáticos y, sin embargo, descubrimos que la mayoría de los linfocitos presentes en la sangre están enfermos. En 1987, un joven visitante de Suecia, Jan Alberts, vino a mi laboratorio. Quería cultivar linfocitos humanos en un medio sintético sin suero y aprender algunas tecnologías sobre el cultivo del VIH. La sorpresa vino cuando comparamos la viabilidad en su medio de linfocitos de donantes sanos y los de pacientes infectados por el VIH, incluso en su etapa temprana asintomática de infección. Mientras que los primeros pudieron sobrevivir varios días sin morir, la mayoría (más del 50%) de los segundos murió muy rápidamente. La adición de interleucina 2 previno parcialmente su muerte.

Cuando utilizamos medio de cultivo normal suplementado con suero de ternero fetal, se observó la misma diferencia, aunque el tiempo de supervivencia de los linfocitos de los pacientes infectados fue mayor.

No pasó mucho tiempo antes de que tres de mis colaboradores encontraran la razón de tales muertes: la apoptosis. Este es un proceso activo por el cual la célula & # 8220decide & # 8221 morir de forma limpia, sin liberar demasiados compuestos tóxicos en el medio.

Es una forma fisiológica de prevenir la proliferación anormal de clones de linfocitos activados, pero aquí el fenómeno fue enorme y no solo afectaba al principal objetivo celular de la infección por VIH, los linfocitos T CD4 +, sino también a las células que no eran infectables por el virus. tales como linfocitos T CD8 +, linfocitos B, monocitos, células asesinas naturales & # 8230 Claramente, era un fenómeno general, el cultivo simplemente revelaba una predisposición a la apoptosis de la mayoría de las células sanguíneas circulantes, aunque la mayoría de ellas no estaban infectadas . De hecho, mi colaboradora Marie-Lise Gougeon encontró una muy buena relación entre in vitro apoptosis y la en vivo caída observada de células T CD4 en pacientes.

Llevamos mucho tiempo intentando encontrar el origen de esta apoptosis masiva, sin encontrar una explicación completamente satisfactoria: lo más probable es el estrés oxidativo intensivo que existe en los pacientes desde el inicio de su infección. Este es también un hallazgo del que estoy muy orgulloso: aunque el estrés oxidativo ha sido, y todavía lo es, por completo ignorado por los investigadores del SIDA, es probable que agrave la activación incorrecta del sistema inmunológico en el origen de su declive y también desencadena la inflamación. a través de la producción de citocinas.

Por supuesto, surge la siguiente pregunta: ¿cuáles son los factores que causan el estrés oxidativo: proteínas virales, fragmentos de ADN viral, coinfección con micoplasmas? Incluso después de 25 años, todavía no sabemos la respuesta completa. Pero el fenómeno existe y necesita ser tratado, ¡mientras que a la mayoría de los médicos del SIDA no les importa en absoluto!

El tratamiento con terapia antirretroviral combinada ha cambiado, sin duda, el pronóstico de esta enfermedad letal, de una sentencia de muerte a una vida casi & # 8220normal & # 8221. Sin embargo, el virus sigue ahí, listo para multiplicarse cuando se interrumpe el tratamiento, y no todos los pacientes infectados por el VIH en el mundo en desarrollo tienen acceso a él. Y las epidemias todavía matan de 2 a 3 millones de personas cada año. Por tanto, es absolutamente necesario resolver estos problemas. La investigación básica, así como la investigación clínica, debe continuar.

Además, en la década de 1990 me di cuenta de que la investigación no solo debería localizarse en los laboratorios ricos de los países desarrollados, sino también en los países del sur, donde muchos pacientes padecían sida y muchas otras enfermedades como la tuberculosis y la malaria.

Demasiados ejemplos mostraron que la colaboración entre los laboratorios de investigación del norte y del sur es desigual, y el sur proporciona muestras de suero para analizar en el norte. Este concepto & # 8220safari & # 8221 es incorrecto. En la actualidad, hay muchos investigadores jóvenes formados en laboratorios del norte que quisieran regresar a sus propios países, pero no pueden hacerlo porque faltan laboratorios y estructuras adecuadas. Además, hay que estar en las regiones donde proliferan las enfermedades para darse cuenta de lo compleja que es la realidad.

Por eso me uní al ex Director General de la UNESCO, Federico Mayor, para iniciar una fundación destinada a crear centros de investigación y prevención en países africanos. Aunque la tarea fue difícil, este concepto fue recibido con entusiasmo por colegas y médicos y también encontró el apoyo de los gobiernos, particularmente en Côte d & # 8217Ivoire y Camerún.

Ojalá, basándose en estos experimentos piloto, toda una red de centros similares pudiera cubrir todos los países del mundo en desarrollo donde las poblaciones se ven gravemente afectadas por epidemias.

Otra lección que extraje de mi experiencia con el SIDA fue el efecto debilitador del estrés oxidativo en el sistema inmunológico y su papel proinflamatorio en muchas enfermedades crónicas, como Parkinson y # 8217, Alzheimer y artritis reumatoide: ¿una posible consecuencia de las infecciones crónicas? ¿O tanto la consecuencia como la causa? Hay muchas preguntas que solo pueden resolverse mediante el trabajo arduo y el pensamiento innovador. Espero poder continuar con ambos.

De Les Prix Nobel. Los premios Nobel 2008, Editor Karl Grandin, [Fundación Nobel], Estocolmo, 2009

Esta autobiografía / biografía fue escrita en el momento del premio y luego publicada en la serie de libros. Les Prix Nobel / Nobel Lectures / Los premios Nobel. A veces, la información se actualiza con un apéndice presentado por el Laureado.

Copyright y copia La Fundación Nobel 2008

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Estilo MLA: Luc Montagnier & # 8211 Biográfico. NobelPrize.org. Nobel Prize Outreach AB 2021. Mié. 30 de junio de 2021. & lth https://www.nobelprize.org/prizes/medicine/2008/montagnier/biographical/>

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Premios Nobel 2020

Doce galardonados fueron galardonados con el Premio Nobel en 2020, por los logros que han conferido el mayor beneficio a la humanidad.

Su trabajo y descubrimientos van desde la formación de agujeros negros y tijeras genéticas hasta los esfuerzos para combatir el hambre y desarrollar nuevos formatos de subastas.


Los biólogos descubren la historia de los retrovirus antiguos hace 33 millones de años

Un grupo de científicos del Boston College, Chestnut Hill, ha reconstruido la historia natural de un linaje de retrovirus específico & # 8212 ERV-Fc & # 8212 que se diseminó ampliamente hace entre 33 y 15 millones de años (Oligoceno y Mioceno temprano).

Partículas de retrovirus que brotan de las células de la placenta del macaco rhesus. Crédito de la imagen: Dorothy Feldman, a través de aacrjournals.org.

Los retrovirus son abundantes en la naturaleza e incluyen virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1 y VIH-2), virus de leucemia de células T humanas (HTLV-1 y -2) y los retrovirus oncogénicos bien estudiados de ratones y otros organismos modelo, entre muchos otros.

Los hallazgos del equipo, publicados en línea el 8 de marzo de 2016, en la revista eLife, muestran que un antiguo grupo de retrovirus conocido como ERV-Fc infectó a los antepasados ​​de al menos 28 especies de mamíferos & # 8212 incluyendo carnívoros, roedores y primates & # 8212 hace entre 15 y 33 millones de años.

La distribución de retrovirus ERV-Fc entre estos mamíferos antiguos sugiere que los virus se propagaron a todos los continentes excepto la Antártida y Australia, y que saltaron de una especie a otra más de 20 veces.

El estudio también sitúa los orígenes de ERV-Fc al menos desde el comienzo del Oligoceno.

"Desafortunadamente, los virus no dejan fósiles atrás, lo que significa que sabemos muy poco sobre cómo se originan y evolucionan", dijo el miembro del equipo, el profesor Welkin Johnson, del Departamento de Biología del Boston College.

"Sin embargo, a lo largo de millones de años, las secuencias genéticas virales se acumulan en los genomas de ADN de los organismos vivos, incluidos los humanos, y pueden servir como 'fósiles' moleculares para explorar la historia natural de los virus y sus huéspedes".

Utilizando estos restos "fósiles", el profesor Johnson y sus coautores intentaron descubrir la historia natural de ERV-Fc.

Tenían especial curiosidad por saber dónde y cuándo se encontraron estos patógenos en el mundo antiguo, qué especies infectaron y cómo se adaptaron a sus huéspedes mamíferos.

Para hacer esto, primero realizaron una búsqueda exhaustiva de bases de datos de secuencias del genoma de mamíferos para loci ERV-Fc y luego compararon las secuencias recuperadas.

Para cada genoma con suficiente secuencia ERV-Fc, reconstruyeron las secuencias de proteínas que representan el virus que colonizó a los ancestros de esa especie en particular.

Estas secuencias se utilizaron luego para inferir la historia natural y las relaciones evolutivas de los virus relacionados con ERV-Fc.

"Los genomas de mamíferos contienen cientos de miles de fósiles virales antiguos similares a ERV-Fc", dijeron los científicos.

"El trabajo futuro podría estudiarlos para mejorar nuestra comprensión de cuándo y por qué surgen nuevos virus y cómo el contacto a largo plazo con los virus afecta la evolución de sus organismos anfitriones".

William E. Diehl et al. 2016. Seguimiento de la transmisión entre especies y la evolución a largo plazo de un antiguo retrovirus utilizando los genomas de mamíferos modernos. eLife 5: e12704 doi: 10.7554 / eLife.12704


La proteína de unión a ARN IGF2BP3 dirigida a transcritos oncogénicos promueve la proliferación de progenitores hematopoyéticos

1 Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina David Geffen de UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

2 Departamento de Fisiología Molecular, Celular e Integrativa, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

3 Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, UCSC, Santa Cruz, California, EE. UU.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Texas, EE. UU.

5 Departamento de Química y Bioquímica, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

6 Departamento de Salud de la Mujer y el Niño SDB, Universidad de Padova, Padova, Italia.

7 Jonsson Comprehensive Cancer Center (JCCC) y

8 Broad Stem Cell Research Center, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

Envíe la correspondencia a: Dinesh S. Rao, Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Escuela de Medicina David Geffen de UCLA, 650 Charles E Young Drive, 12-272 Factor, Los Ángeles, California 90095, EE. UU. Teléfono: 310.825.1675 Correo electrónico: [email protected]

Nota de autoría: J. Kumar Palanichamy, T.M. Tran y J.M. Howard contribuyeron igualmente a este trabajo.

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1 Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Facultad de Medicina David Geffen de UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

2 Departamento de Fisiología Molecular, Celular e Integrativa, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

3 Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, UCSC, Santa Cruz, California, EE. UU.

4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Texas, EE. UU.

5 Departamento de Química y Bioquímica, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

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2 Departamento de Fisiología Molecular, Celular e Integrativa, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

3 Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, UCSC, Santa Cruz, California, EE. UU.

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2 Departamento de Fisiología Molecular, Celular e Integrativa, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

3 Departamento de Biología Molecular, Celular y del Desarrollo, UCSC, Santa Cruz, California, EE. UU.

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5 Departamento de Química y Bioquímica, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

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2 Departamento de Fisiología Molecular, Celular e Integrativa, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

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4 Bioo Scientific Corporation, Austin, Texas, EE. UU.

5 Departamento de Química y Bioquímica, UCLA, Los Ángeles, California, EE. UU.

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El control postranscripcional de la expresión génica es importante para definir fenotipos celulares tanto normales como patológicos. In vitro, se ha demostrado recientemente que las proteínas de unión al ARN (RBP) desempeñan un papel importante en la regulación postranscripcional; sin embargo, no se comprende bien la contribución de las RBP a la especificación celular. Aquí, determinamos que la proteína 3 de unión al ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina 2 (IGF2BP3) de RBP se sobreexpresa específicamente en la leucemia linfoblástica aguda B reordenada (reordenamiento MLL) de linaje mixto (LLA-B), que constituye un subtipo de esta neoplasia asociada a mal pronóstico y alto riesgo de recaída. Se requirió IGF2BP3 para la supervivencia de las líneas de células B-ALL, ya que la caída condujo a una disminución de la proliferación y un aumento de la apoptosis. La expresión forzada de IGF2BP3 proporcionó a las células de la médula ósea murina una gran ventaja de supervivencia, condujo a la proliferación de células madre y progenitoras hematopoyéticas, y desarrollo hematopoyético sesgado al linaje de células B / mieloide. La inmunoprecipitación entrecruzada y la secuenciación de alto rendimiento descubrieron el transcriptoma regulado por IGF2BP3, que incluye oncogenes. MI C y CDK6 como objetivos directos. Las transcripciones reguladas por IGF2BP3 a través de elementos de orientación dentro de las regiones 3 'no traducidas (3'UTR) y la expresión de IGF2BP3 forzada en ratones dio como resultado una mayor expresión de Mi c y Cdk6 en BM. Juntos, nuestros datos sugieren que el direccionamiento de transcripciones oncogénicas mediado por IGF2BP3 puede representar un mecanismo patogénico crítico en LLA-B reordenada por MLL y respaldar a IGF2BP3 y sus socios de unión de ARN afines como posibles dianas terapéuticas en esta enfermedad.

La oncogénesis en los progenitores de células B tempranas da como resultado leucemia linfoblástica aguda de células B (LLA-B), la neoplasia hematológica más prevalente en niños y adultos jóvenes (1). La mayoría de los casos de LLA-B presentan alteraciones genéticas, incluidos reordenamientos cromosómicos recurrentes, que contribuyen a la heterogeneidad del comportamiento clínico observado (2). Específicamente, B-ALL con reordenamientos cromosómicos de la leucemia de linaje mixto (MLL) representa del 5% al ​​6% de todos los casos de LLA-B y se asocia con un pronóstico precario y riesgo de recaída precoz después del tratamiento (3). MLL, que codifica una metiltransferasa H3K4, juega un papel crítico en la desregulación transcripcional que ocurre durante la leucemogénesis (3, 4). Los objetivos previamente demostrados de MLL incluyen genes críticos en la supervivencia y proliferación celular, como BCL2, MI C, y CDK6 (5-7). Además, se sabe que la MLL regula la hematopoyesis y su expresión se correlaciona con el mantenimiento de la autorenovación y diferenciación de las células madre hematopoyéticas (HSC) (8, 9). De acuerdo con este papel en la función normal de las HSC, las proteínas de fusión MLL inducen HOXA9 y MEIS1, generando leucemia que muestra propiedades similares a las de las células madre (10 - 12). Estos hallazgos demuestran una conexión íntima entre la desregulación de la expresión génica y la transformación maligna, y destacan la importancia de investigar a los actores clave en la regulación de la expresión génica.

De manera simplista, la expresión génica se puede regular a nivel transcripcional y postranscripcional. Trabajos recientes han revelado la complejidad de este último mecanismo, que no solo incluye secuencias intrínsecas al ARNm regulado, sino también otros factores como miR, proteínas de unión a ARN (RBP) y ARN no codificante (13). Se ha informado de una interacción compleja entre el ARNm que codifica la proteína y la región no traducida 3 '(3' UTR) dirigida a miR y RBP (14). Sin embargo, no se comprende el papel de la regulación de la expresión génica por las RBP en la transformación maligna de las células B. En un esfuerzo por identificar la regulación crítica mediada por RBP en B-ALL, comenzamos examinando un conjunto de datos de alto rendimiento generado en nuestro laboratorio, identificando la proteína de unión al ARNm del factor de crecimiento similar a la insulina 2 3 (IGF2BP3) como uno de los principales genes desregulados en LLA-B translocada por MLL. IGF2BP3 pertenece a una familia de proteínas de unión a ARNm que consta de 3 parálogos relacionados estructural y funcionalmente (IGF2BP1, IGF2BP2 e IGF2BP3) que influyen en el destino citoplásmico de los ARNm a través de la localización, estabilidad y traducción (15, 16). IGF2BP3 es una proteína oncofetal con alta expresión durante la embriogénesis, baja expresión en tejidos adultos y reexpresión en tejidos malignos. En el cáncer epitelial, la expresión de IGF2BP3 se asocia con una variedad de fenotipos neoplásicos (17 - 20). Sin embargo, muchos de estos estudios han sido en gran parte correlativos, y no se ha establecido un papel funcional genuino de IGF2BP3, o cualquier RBP, en la oncogénesis de células B.

En este estudio, buscamos delinear la función de IGF2BP3 en la leucemogénesis de células B. Sobreexpresamos IGF2BP3 en la BM de ratones irradiados letalmente y descubrimos que desempeña un papel fundamental en la proliferación de células madre y progenitoras hematopoyéticas, recapitulando algunas características de la LLA-B reordenada por MLL. IGF2BP3 proporcionó a los progenitores de BM una ventaja de supervivencia competitiva y aumentó su proliferación.También encontramos que IGF2BP3 era esencial para la supervivencia de las líneas celulares B-ALL. Utilizamos inmunoprecipitación de reticulación de resolución de nucleótidos individuales (iCLIP) para capturar la especificidad in situ de las interacciones proteína-ARN y para revelar el contexto posicional de los sitios de unión de proteínas a través del transcriptoma. En total, identificamos sitios de unión de IGF2BP3 en varios cientos de transcripciones en 2 líneas celulares B-ALL. Los sitios de reticulación de IGF2BP3 están fuertemente enriquecidos en las 3'UTR de las transcripciones diana. De las muchas transcripciones de objetivos de IGF2BP3, demostramos una mejora de la expresión de objetivos oncogénicos mediada por IGF2BP3 CDK6 y MI C en células B-ALL y células progenitoras hematopoyéticas in vivo. La deleción de los dominios de unión al ARN de IGF2BP3 anuló la unión del ARNm diana, así como la expansión del progenitor y del tallo hematopoyético. Juntos, nuestros estudios sugieren que la regulación positiva de dianas oncogénicas mediada por IGF2BP3 representa un mecanismo patogénico clave operante en LLA-B reordenada por MLL.

IGF2BP3 se expresa diferencialmente en B-ALL reordenado por MLL. Hemos descrito previamente un experimento de microarrays realizado en muestras de pacientes B-ALL (21). Después de la corrección para las pruebas de hipótesis múltiples, realizamos un agrupamiento jerárquico no supervisado con genes codificantes de proteínas expresados ​​significativamente diferencialmente (ajustados PAG ≤ 0,01). Esto generó una lista de RBP expresadas diferencialmente entre los 3 subtipos citogenéticos de B-ALL utilizados en nuestros experimentos de microarrays (ETV-RUNX1, E2A-PBX y MLL reordenado). En la lista de RBP cuya expresión fue más alta en la leucemia con reordenamiento MLL, IGF2BP3 estuvo entre los mejores candidatos (Figura 1A). Las leucemias con reordenamiento de MLL muestran una firma de células madre con alta expresión de genes asociados a la madre como HOXA9, MEIS1, y CD44 (11, 22). Concordante con esto, observamos que HOXA9, MEIS1A, CDK6, y MI C - objetivos putativos de la proteína de fusión MLL oncogénica - se sobreexpresaron significativamente en el grupo reordenado de MLL en comparación con los otros 2 subconjuntos (Figura complementaria 1, A – D). Al realizar una PCR cuantitativa (qPCR) en una gran cohorte de MO derivadas de pacientes con LLA-B, confirmamos que IGF2BP3 y CD44 fueron altamente expresados ​​en el grupo MLL (total norte = 134) (Figura 1, B y C). Adicionalmente, IGF2BP3 la expresión fue significativamente mayor en todas las muestras de B-ALL en comparación con las células B CD19 + aisladas de donantes sanos (Figura 1B). Para examinar la dependencia de IGF2BP3 de los efectos mediados por MLL sobre la expresión génica, utilizamos I-BET151, un bromodominio y un inhibidor del dominio extra terminal (BET) que recientemente se ha demostrado que inhibe la expresión génica dependiente de MLL (23). El tratamiento de RS411, una línea celular de LLA-B humana que expresa MLL-AF4, con I-BET151 provocó una disminución dependiente de la dosis en la expresión de MI C, CDK6, y IGF2BP3 (Figura 1D). También provocó la detención del ciclo celular en la fase G1-S (Figura 1, E y F). Estos experimentos confirman la sobreexpresión de IGF2BP3 en B-ALL, con la expresión más alta observada en B-ALL con reordenamiento de MLL. En consonancia con el hecho de que IGF2BP3 está aguas abajo de las proteínas de fusión MLL, una caída en IGF2BP3 Los niveles de ARNm, junto con una caída en otros niveles diana de MLL-AF4, se observan después de la inhibición de BET.

IGF2BP3 se sobreexpresa en B-ALL con translocación de MLL. (A) Mapa de calor de los datos de microarrays que muestran las RBP expresadas diferencialmente entre B-ALL. IGF2BP3 se expresa en gran medida en LLA-B reordenada por MLL. (B y C) Confirmación basada en qPCR de sobreexpresión de IGF2BP3 (B) y su objetivo previamente definido, CD44 (C), en B-ALL reordenado MLL (total norte = 134 ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001, ****PAG & lt 0,0001). (DF) Tratamiento de la línea celular RS411 con dosis crecientes de I-BET151. (D) qPCR de MI C, CDK6, y IGF2BP3 Los niveles en las células RS411 muestran una disminución significativa en los 3 niveles de ARNm (t prueba MI C, PAG = 0.04, PAG = 0.06 IGF2BP3, PAG & lt 0,0001, PAG = 0.1 CDK6, PAG = 0.005, PAG = 0,004 1 μM y 2 μM, respectivamente). (mi y F) El análisis del ciclo celular mediante tinción con yoduro de propidio después del tratamiento con I-BET151 de células RS411 muestra una detención de G1 secundaria a la inhibición de CDK6. Los experimentos se realizaron 3 veces para la validación. Los ensayos de qPCR se normalizaron a actina (B y C) y ARN Pol II (D). Los datos representan la media ± DE. Consulte también la Figura complementaria 1.

La pérdida de función de IGF2BP3 causa apoptosis en las células B-ALL. Dado el patrón de expresión oncogénica de IG2BP3 en B-ALL humana, se procedió a examinar su expresión en 4 líneas celulares B-ALL diferentes, incluidas 697 (E2A-PBX translocada), RS411, REH (ETV-RUNX1 translocada) y NALM6 ( Figura 2A). Para examinar los efectos de la caída de IGF2BP3, utilizamos un vector lentiviral que expresa 2 secuencias de ARNip con formato de miR diferentes para transducir células RS411 (Figura 2B). Ambos ARNip causaron disminución IGF2BP3 expresión por qPCR (Figura 2C). La tinción con yoduro de propidio mostró un aumento en la fracción apoptótica sub-G1 y 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazolio (MTS ) el ensayo mostró una reducción significativa en la proliferación celular con caída de IGF2BP3, lo que confirma la dependencia de las líneas celulares B-ALL de IGF2BP3 para la supervivencia (Figura 2, D y E). Supresión del IGF2BP3 también se llevó a cabo el locus utilizando el sistema CRISPR-Cas9 en la línea celular RS411. Utilizamos el sistema LentiCRISPR (24) con 2 hebras de guía diferentes, Cr1 y Cr2, para apuntar a la IGF2BP3 locus para la eliminación. La deleción mediada por CRISPR se confirmó mediante un ensayo de endonucleasa T7 (Figura complementaria 2, D y E) con la abrogación completa de la proteína IGF2BP3 con el ARN guía Cr2, mientras que la proteína residual se detectó con Cr1 (Figura 2F). La deleción mediada por Cr2 dio como resultado una reducción de la proliferación celular mediante el ensayo MTS, un aumento de la tinción sub-G1 y un aumento de la positividad de la anexina V (Figura 2, G – I). Para confirmar estos hallazgos, también nos dirigimos a IGF2BP3 para la eliminación en las células NALM6 utilizando un sistema de expresión de ARNip lentiviral (Figura complementaria 2A). Reducido IGF2BP3 Se observaron niveles de ARNm con ambos ARNip, y si2 proporcionó una reducción más fuerte en la proliferación celular, como se ve en el ensayo MTS (Figura complementaria 2, B y C). Juntos, estos hallazgos destacan la importancia de IGF2BP3 en el mantenimiento de la supervivencia y proliferación celular en B-ALL.

La caída de IGF2BP3 conduce a interrupciones del crecimiento celular y aumento de la apoptosis. (A) IGF2BP3 expresión en líneas celulares B-ALL humanas. (B) Esquema del vector lentiviral utilizado para la eliminación de IGF2BP3. (C) IGF2BP3 derribo, medido por qPCR mostrado en la línea celular RS411 (t prueba ***PAG = 0.0005). (D) Análisis del ciclo celular con tinción de yoduro de propidio. (mi) Ensayo MTS que muestra una proliferación celular significativamente reducida con caída de IGF2BP3. (F) Western blot que muestra la expresión de IGF2BP3 después de la focalización mediada por CRISPR-Cas9 utilizando las construcciones Cr1 o Cr2. El direccionamiento mediado por Cr1 da como resultado algo de proteína residual. La β-actina se utiliza como control de carga. (GRAMO) Ensayo MTS que muestra una proliferación celular significativamente reducida después de la selección de Cr2 (t prueba **PAG ≤ 0,01 para todas las comparaciones marcadas). (H) Análisis del ciclo celular mediante tinción con yoduro de propidio que muestra un aumento de la muerte celular (pico sub-G1) en células que expresan Cr2. (I) Aumento de la tinción de anexina V en células dirigidas a Cr2 con IGF2BP3 KO. I3, IGF2BP3. Los experimentos se realizaron 3 veces para su validación. Los datos representan la media ± DE. Véase también la figura complementaria 2. UbC, promotor de ubiquitina C Puro, puromicina LC, control lentiCRISPR.

La expresión forzada de IGF2BP3 conduce a altos niveles de injerto y aumento de leucocitos. Para evaluar directamente el papel de IGF2BP3 en el sistema hematopoyético, realizamos un experimento in vivo para examinar los efectos de la expresión forzada. Inicialmente clonamos la secuencia codificante humana o de ratón de IGF2BP3 en MIG, un vector retroviral basado en virus de células madre murinas (basado en MSCV) (Figura 3A), y confirmamos la funcionalidad del vector en la expresión de IGF2BP3 y el marcador GFP (Figura 3A). 3, B – D y datos no mostrados). Un sangrado periférico de estos ratones a las 4 semanas mostró un aumento significativo en las células GFP + que se mantuvo a lo largo del tiempo en ratones con expresión forzada de humanos y ratones. IGF2BP3, medido por los marcadores congénicos CD45.2 versus CD45.1 FACS (Figura 3, E y F). Además, se encontraron células leucocitarias GFP + significativamente aumentadas, lo que confirma el aumento de la producción hematopoyética atribuible a la expresión de IGF2BP3 (Figura 3G). Estos cambios se limitaron a los recuentos de células B y células mieloides en la sangre periférica después del injerto completo (Figura 3, H e I). No hubo diferencia en el número de células T en la periferia (Figura 3J). Curiosamente, el número de plaquetas y glóbulos rojos fue significativamente menor con la expresión reforzada de IGF2BP3 (Figura 3, K y L). Juntos, estos hallazgos sugieren que IGF2BP3 promueve la producción hematopoyética general de la MO y sesga el desarrollo de la BM hacia el linaje de células B / mieloide y lejos de las células T, células eritroides y megacariocitos. Estos hallazgos, en particular el aumento preferencial de células B y células mieloides, son interesantes a la luz del hecho de que los reordenamientos de MLL se encuentran no solo en B-ALL, sino también en leucemia mieloide aguda y leucemia aguda de linaje mixto, que expresan con mayor frecuencia tanto B marcadores celulares y mieloides.

La expresión forzada de IGF2BP3 conduce a un injerto mejorado y un sesgo hacia el desarrollo de células B / mieloide. (A) Esquema del vector bicistrónico utilizado para la expresión forzada de IGF2BP3. (B) Western blot que muestra la sobreexpresión de IGF2BP3 en la línea de células pre-B murinas, 7OZ / 3, y la línea de células de riñón embrionario humano, 293T. (C) qPCR que muestra sobreexpresión en 7OZ / 3 a nivel de ARNm (t prueba **PAG = 0.0013). (D) Análisis FACS de PB de ratones 6 semanas después de BMT que muestra un injerto y transducción exitosos (GFP +). (mi) FACS de PB realizado 4 semanas después del BMT, que muestra positividad para CD45.2 y GFP (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Bonferroni ****PAG & lt 0,0001). (F) La cuantificación de la expresión de GFP en el PB entre 4 y 16 semanas después del trasplante muestra que el efecto es marcado y sostenido. (GRAMO) Los recuentos de leucocitos PB a las 16 semanas muestran un aumento de leucocitos (ANOVA de una vía con la prueba de Bonferroni ***PAG & lt 0,001). (H y I) Números significativamente más altos de celdas B220 + (H) y células CD11b + (I) en PB (ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni ***PAG & lt 0,001). (J) La enumeración de células T basada en FACS no muestra cambios significativos en las células T circulantes. (K y L) La enumeración de glóbulos rojos y plaquetas por CBC muestra reducciones significativas (ANOVA unidireccional con la prueba de Bonferroni ***PAG & lt 0,001, ****PAG & lt 0,0001). norte = 8 para los 3 grupos. PB, BMT de sangre periférica, trasplante de BM hI3, IGF2BP3 mI3 humano, CBC de IGF2BP3 murino, hemograma completo LTR, IRES de repetición terminal larga, sitio de entrada de ribosoma interno. Se completaron tres experimentos de BMT separados para su validación. Los datos representan la media ± DE.

La expresión forzada de IGF2BP3 conduce a un aumento de progenitores en la MO con mayores tasas de proliferación. Para caracterizar aún más estos cambios hematopoyéticos, se sacrificaron ratones que sobreexpresaban IGF2BP3 y se recogieron órganos hematopoyéticos para su análisis 6 meses después del trasplante. El porcentaje de células GFP + fue significativamente mayor en la BM que sobreexpresa IGF2BP3, similar a la sangre periférica (Figura complementaria 3, A y B). La proporción global de células mieloides y B en la BM fue similar entre los ratones de control y los que expresan IGF2BP3 (Figura complementaria 3, C y D). La qPCR del ARN recogido de la BM de ratón confirmó la sobreexpresión de IGF2BP3 humana y de ratón (Figura complementaria 3, E y F). Estos cambios nos llevaron a preguntarnos si hubo cambios en los progenitores hematopoyéticos en la MO. De hecho, la expresión forzada de IGF2BP3 condujo a un aumento en la fracción de HSC, progenitores multipotentes activados por linfoides (LMPP) y progenitores linfoides comunes (CLP) (Figura 4, A – C). Seguimos la ruta de desarrollo de las células B siguiendo el esquema creado por Hardy et al. (25). Entre las fracciones de Hardy, observamos un aumento significativo en el número de células en las fracciones A y B sin diferencias significativas observadas en las etapas posteriores del desarrollo (Figura complementaria 3, H, I y K). Por lo tanto, la sobreexpresión de IGF2BP3 condujo a un aumento de las fracciones hematopoyéticas inmaduras comenzando al nivel de las HSC y hasta la etapa de células pro-B. Para analizar la tasa de proliferación de las diversas células progenitoras en la BM, realizamos tinción intracelular con Ki67 junto con tinciones de células progenitoras. Ki67 fue significativamente mayor en la población Lin - Sca1 + c-Kit + (LSK) y las LMPP en BM que sobreexpresa IGF2BP3 (Figura 4, D y E). Los CLP no mostraron una diferencia significativa en la expresión de Ki67 (Figura complementaria 3, G y J). Estos hallazgos implican un aumento en la tasa de proliferación de los progenitores tempranos (HSC y LMPP), secundario al aumento de la expresión de IGF2BP3. Presumiblemente, esto conduce a un aumento en su número y a la diferenciación en progenitores descendentes más comprometidos (CLP y fracciones A y B de Hardy). Por tanto, la expresión forzada de IGF2BP3 provoca un aumento preferencial en el número y la proliferación de poblaciones de progenitores tempranos, lo que lleva a la leucocitosis observada sesgada de células B y mieloide observada en la periferia.

Análisis de poblaciones progenitoras de BM de ratones que sobreexpresan IGF2BP3. (A) Enumeración (panel izquierdo) e histogramas de citometría de flujo representativos para definir las HSC del vector de control (segundo panel desde la izquierda), IGF2BP3 humano (segundo desde la derecha) y ratones que sobreexpresan IGF2BP3 murino (panel derecho). (B y C) Análisis de LMPP y CLP de ratones anotados como en A. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas en LMPP y CLP. (D) Tinción intracelular Ki67 y análisis basados ​​en FACS, representados de la misma manera, con enumeración en el lado izquierdo, dentro de la población LSK enriquecida para HSC. Se encontraron diferencias significativas en la población de alta expresión de Ki67. (mi) La tinción intracelular con Ki67 y el análisis FACS de la proliferación en la población de LMPP muestra diferencias significativas en la fracción proliferativa. Todas las comparaciones utilizaron ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Bonferroni. *PAG & lt 0.05 **PAG & lt 0.01 ***PAG & lt 0,001 ****PAG & lt 0,0001. LSK, Lin - Sca1 hi c-Kit hi. Se completaron tres experimentos de BMT separados para su validación. Los datos representan la media ± DE. Véase también la Figura complementaria 3. hI3, IGF2BP3 humano mI3, IGF2BP3 murino.

IGF2BP3 aumenta el número de células B en el timo y células mieloides en el bazo. El timo normal del ratón está compuesto principalmente por progenitores de células T, pero en muchos modelos murinos de leucemia y linfoma, se agranda y se ve invadido por leucocitos malignos (26). En el examen microscópico, IGF2BP3 causó expansión medular tímica con infiltración de células grandes. Uno de los timios que expresaban IGF2BP3 humano tenía una ablación completa de la unión cortico-medular (Figura 5A). Por tanto, la expresión de IGF2BP3 puede servir como precursor de la transformación maligna. Observamos un porcentaje significativamente mayor de células B GFP + B220 + en el timo cuando se sobreexpresa IGF2BP3 humana o de ratón, siendo el efecto más pronunciado con IGF2BP3 de ratón (Figura 5, B y C). Los ratones con expresión forzada de IGF2BP3 de ratón también mostraron una disminución sustancial en el número de células T CD3ε +. No hubo diferencia significativa en el nivel de células GFP + en estos timios, lo que indica una expansión específica de linaje de células B (Figura complementaria 4, G – I). Cuatro de 8 de los timis que sobreexpresan IGF2BP3 humano y 1/8 de los timis que sobreexpresan IGF2BP3 de ratón pesaron más de 50 mg, sin tal aumento en los ratones de control (datos no mostrados). Curiosamente, los bazos también se agrandaron después de la expresión forzada de IGF2BP3. Las diferencias en el peso esplénico fueron estadísticamente significativas para los ratones con sobreexpresión de IGF2BP3 humana con una tendencia observada para el grupo de IGF2BP3 de ratón (Figura 4A suplementaria). IGF2BP3 condujo a un aumento en el número de células mieloides en el bazo con una disminución significativa en el número de células T CD3ε + (Figura complementaria 4, B – F). En general, IGF2BP3 parece inclinar el programa de desarrollo hematopoyético hacia los linajes de células B y mieloide. Por lo tanto, los cambios observados en la MO (mayor número y proliferación de progenitores linfoides y mieloides B) pueden producir alteraciones en la homeostasis hematopoyética en la periferia.

Análisis de la composición celular tímica y la ventaja competitiva de repoblación de ratones que sobreexpresan IGF2BP3. (A) Imágenes histológicas de secciones tímicas de ratones con expresión forzada de IGF2BP3. Tinción H & ampE. Barra de escala: 40 μm. (B y C) Gráficos representativos de FACS y enumeración que muestran un aumento en las células B220 + en el timo de ratones con expresión forzada (ANOVA unidireccional con prueba de Bonferroni **PAG & lt 0,01). Consulte también la Figura complementaria 4. norte = 8 para los 3 grupos. Se completaron tres experimentos de BMT separados para su validación. (DH) Estudio de repoblación competitiva. (D) Cuantificación de la expresión de GFP en el PB entre 4 y 20 semanas después del trasplante en un estudio de repoblación competitiva de IGF2BP3. (miGRAMO) FACS de PB (mi), BM (F) y el timo (GRAMO) realizado 20 semanas después del BMT, que muestra positividad para CD45.2 y GFP (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Bonferroni **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001). (H) qPCR confirmación de sobreexpresión de IGF2BP3 en ratón BM (t prueba ***PAG = 0.0006). norte = 8 (MIG), norte = 8 (Hoxa9), norte = 5 (hI3), y norte = 4 (100% CD45.1). El estudio de repoblación competitiva se completó 3 veces para su validación. Los datos representan la media ± DE. hI3, IGF2BP3 mI3 humano, PB de IGF2BP3 murino, sangre periférica.

IGF2BP3 proporciona a los progenitores hematopoyéticos una ventaja de supervivencia. Para confirmar que la sobreexpresión de IGF2BP3 equipó a los progenitores de BM con una ventaja al repoblar la BM de ratón huésped irradiada, realizamos un ensayo de trasplante de repoblación competitivo formal. El cincuenta por ciento de las células BM CD45.1 se mezclaron con el 50% de células BM CD45.2 que sobreexpresan MIG o IGF2BP3 o HOXA9 y se inyectaron en ratones irradiados letalmente. Las células CD45.2 que sobreexpresan IGF2BP3 tuvieron una clara ventaja sobre las células que expresan MIG o MIG-HOXA9 en el injerto en las hemorragias periféricas a lo largo del tiempo (Figura 5, D y E). La recolección de la BM reveló que IGF2BP3 confería una ventaja competitiva a las células en la BM (Figura 5F). Esto también se reflejó en el timo (Figura 5G).Esto corrobora nuestros datos anteriores que muestran la sobreexpresión de IGF2BP3 (Figura 5H) que conduce a un aumento en el número de progenitores de BM, así como en la tasa de proliferación.

iCLIP identifica el interactoma IGF2BP3-RNA en células B-ALL. La base molecular de la acción de las RBP se ha investigado recientemente utilizando iCLIP y secuenciación de alto rendimiento. Para obtener información sobre el papel de IGF2BP3 en el crecimiento celular y la leucemogénesis impulsada por MLL, realizamos un ensayo iCLIP con esta proteína. iCLIP explota la fotorreactividad de los residuos de ácidos nucleicos y proteínas y la fragmentación de nucleasas de las transcripciones unidas a proteínas para capturar las interacciones proteína-ARN que se producen in situ. Se usaron anticuerpos contra IGF2BP3 para inmunoprecipitar complejos de proteína-ARN de células RS411 y REH de control o irradiadas con UV (entrada mostrada en la Figura Suplementaria 5, A y C). Como se esperaba, el material inmunoprecipitado era dependiente de anticuerpos y dependiente de UV, y la movilidad electroforética del complejo era sensible a nucleasa, como se predijo para un complejo de proteína-ARN (Figura complementaria 5, B y D). El ARN coprecipitado se convirtió en bibliotecas de ADNc (Figura complementaria 5E) y se sometió a una secuenciación de alto rendimiento. Después de tener en cuenta las duplicaciones de PCR, obtuvimos aproximadamente 1 millón de lecturas por réplica, de las cuales & gt70% se asignaron únicamente al genoma humano (Tabla complementaria 1). Las secuencias de iCLIP replicadas de las células RS411 y REH fueron altamente reproducibles (Figura complementaria 6, D y E). En comparación con los sitios de entrecruzamiento de iCLIP para ribonucleoproteína A1 heterogénea (células HEK hnRNPA1) y con datos simulados extraídos al azar del genoma, los sitios de entrecruzamiento de IGF2BP3, ubicados en el extremo 5 'de las secuencias de iCLIP, estaban enriquecidos en exones (Figura 6A) .

Análisis iCLIP de IGF2BP3 en líneas celulares de leucemia humana. (A) Proporción de IGF2BP3 (células REH y RS411), hnRNPA1 (células HEK) y sitios de entrecruzamiento simulados (genoma) observados en exones, intrones o regiones no anotadas del genoma humano. (B) Proporción de IGF2BP3 (células REH y RS411), hnRNPA1 (células HEK) y sitios de unión simulados (fondo de ARNm) en exones codificantes y no codificantes. (C) Enriquecimiento de la secuencia de tetramero en los sitios de reticulación de IGF2BP3 en las células RS411 y REH (panel superior e inferior, respectivamente). (D) Densidad de sitios de reticulación de IGF2BP3 (REH, RS411) y hnRNPA1 (células HEK) con respecto a los codones de terminación. (mi) Densidad de reticulación de IGF2BP3 de las líneas celulares REH (línea azul oscuro) y RS411 (línea azul claro) mapeadas en relación con los sitios objetivo de miR anotados. Los sitios de entrecruzamiento de hnRNPA1 (línea negra) de las células HEK293 se incluyen como control. (F y GRAMO) Instantánea de UCSC Genome Browser del CDK6 y MI C 3'UTR loci, respectivamente. Cada panel muestra la estructura exón-intrón del gen, la conservación de la secuencia en las especies de vertebrados y la cobertura de lectura única de 2 réplicas de iCLIP de cada línea celular. El número máximo de lecturas en cada posición se indica a la izquierda de cada histograma. Consulte también las Figuras complementarias 5 y 6. (H) Western blot de muestras de proteínas de IGF2BP3 RIP. La entrada se refiere al lisado de células RS411 utilizado para la inmunoprecipitación. FT es el flujo a través de la inmunoprecipitación desde el control (IgG de ratón) o IGF2BP3 RIP. RIP es inmunoprecipitación de ARN de control (IgG de ratón) o anticuerpo α-IGF2BP3 (D-7). (I) Gráficos de barras de dispersión que comparan el enriquecimiento de pliegues para MI C (norte = 4, t prueba **PAG & lt 0.01) y CDK6 (norte = 3, t prueba *PAG & lt 0,05) en inmunoprecipitaciones de ARN de control (IgG de ratón) e inmunoprecipitaciones de anticuerpo α-IGF2BP3. Niveles de MI C y CDK6 se normalizan a los niveles de entrada del ARN total con ARNr 18s como referencia.

Identificamos picos usando un modelo binomial negativo (ver Métodos) en cada réplica biológica de células RS411 y REH. En total, se identificaron 849 picos en 669 genes y 1937 picos en 1149 genes en los experimentos iCLIP de REH y RS411, respectivamente. De los picos llamados dentro de las secuencias de ARNm, la mayoría se ubicaron dentro de las 3 ′ UTR (Figura 6B y Figura 6 complementaria, A – C). Una búsqueda de especificidad de secuencia en regiones reticuladas reveló un enriquecimiento de 8 a 16 veces de motivos que contienen tetrámero GCAC sobre el fondo en los conjuntos de datos REH y RS411 (Figura 6C). Dado el aparente sesgo de los sitios de unión de IGF2BP3 en 3'UTR de las transcripciones diana, investigamos el sesgo posicional de los sitios de entrecruzamiento en una resolución de un solo nucleótido en relación con los codones de terminación del ARNm. La densidad de reticulación de IGF2BP3 difería de hnRNPA1 en el 3'UTR, alcanzando su vértice justo aguas abajo del codón de terminación. Estos datos sugirieron que los sitios de unión de IGF2BP3 dentro de la 3'UTR se dirigen específicamente a secuencias cercanas al codón de terminación en ambas líneas celulares B-ALL (Figura 6D).

Basándonos en la distribución de los sitios de entrecruzamiento de IGF2BP3 dentro de las 3'UTR (Figura 6D), planteamos la hipótesis de que los sitios de unión de IGF2BP3 pueden superponerse con cis-características reguladoras asociadas con la regulación génica mediada por 3'UTR. Para investigar esta posibilidad, examinamos la distribución de los sitios de reticulación de IGF2BP3 en relación con los sitios objetivo de miR en las 2 líneas celulares diferentes. Después de corregir la distribución de fondo uniforme de los sitios de enlace cruzado simulados, encontramos que la densidad de enlace cruzado IGF2BP3 en las líneas celulares REH y RS411 está altamente enriquecida dentro de una ventana de 25 pb centrada en las secuencias objetivo de miR predichas (Figura 6E). Por el contrario, la densidad de los sitios de entrecruzamiento de hnRNPA1 se distribuyó uniformemente en relación con los sitios objetivo de miR. Entre los genes con una señal fuerte por secuenciación iCLIP (CLIP-Seq) se encuentran CDK6 y MI C. Para confirmar nuestros hallazgos que demuestran la interacción de IGF2BP3 con estos 2 objetivos por iCLIP (Figura 6, F y G), utilizamos inmunoprecipitación de ARN (RIP Figura 6H), que mostró enriquecimiento de MI C y CDK6 (Figura 6I) en RIP de IGF2BP3 sobre el control de IgG de ratón. Estos datos demuestran, por primera vez hasta donde sabemos, un atlas completo de sitios de interacción de ARN de IGF2BP3 de células de leucemia humana. Este extenso mapa de interacción revela una fuerte preferencia de IGF2BP3 que se une de manera no uniforme a 3'UTR con preferencia por un motivo de consenso rico en GCAC cerca de los sitios diana de miR.

IGF2BP3 modula la expresión de sus objetivos. Se utilizó la herramienta ENRICHR (27) para clasificar funcionalmente IGF2BP3 Dianas de ARNm en células REH y RS411. En ambas líneas celulares, encontramos que las transcripciones diana se enriquecieron para las vías de KEGG relacionadas con la biogénesis y la traducción de los ribosomas (Tabla complementaria 2). Por el contrario, las transcripciones clasificadas por ENRICHR como implicadas en patógenos E. coli infección, y quizás lo más importante, la leucemia mieloide crónica (LMC) se enriquecieron en RS411 pero no en el conjunto de datos REH (Tabla complementaria 2). Por lo tanto, queríamos explorar más a fondo las consecuencias funcionales de la unión de IGF2BP3 en la expresión génica a nivel global. Para determinar si los objetivos de IGF2BP3 iCLIP (Tabla complementaria 3) están regulados por los niveles de expresión de IGF2BP3, realizamos RNA-Seq en el control y en células RS411 empobrecidas en IGF2BP3 (Tabla complementaria 4). La validación cruzada de genes expresados ​​diferencialmente por al menos 1,5 veces con dianas iCLIP IGF2BP3 específicas de RS411 encontró 216 genes comunes. De estos objetivos, la mayoría mostró una disminución de la expresión de los objetivos iCLIP de IGF2BP3 con agotamiento de IGF2BP3 (157 disminuyeron frente a 59 aumentaron en la Figura 7A). Utilizando la herramienta ENRICHR para clasificar la cohorte de genes comunes, el análisis de ontología genética de la enfermedad OMIM (análisis GO) reveló genes asociados con la leucemogénesis (círculos negros de la Figura 7A), que incluyen CDK6 y MI C. El análisis de GO para las dianas iCLIP de IGF2BP3 reguladas negativamente reveló genes asociados con el control postranscripcional, la diferenciación de células hematopoyéticas y la modificación de la cromatina (Figura 7C). El análisis de la vía KEGG también sugirió que estos objetivos están involucrados en el ciclo celular y en una variedad de vías del cáncer (Figura 7C). Por el contrario, las dianas iCLIP de IGF2BP3 reguladas al alza revelaron genes asociados principalmente con la traducción y la localización de proteínas (Figura 7B).

Validación cruzada de dianas iCLIP de IGF2BP3 con genes expresados ​​diferencialmente sensibles a IGF2BP3. (A) Gráfico de volcán de genes expresados ​​diferencialmente (puntos azules) determinados usando análisis DESeq en muestras de RNA-Seq de células RS411 de control y de eliminación de IGF2BP3 (como se describe en la Figura 2). Los genes expresados ​​diferencialmente identificados como dianas de IGF2BP3 por iCLIP están resaltados (puntos naranjas). Los puntos delimitados por contornos negros son genes leucemogénicos por análisis GO de vías de enfermedades asociadas a OMIM. Las líneas punteadas representan un cambio de 1,5 veces en la expresión (líneas verticales) y PAG & lt 0,05 de corte (línea horizontal). (B y C) Análisis GO de subgrupos de genes que muestran una expresión aumentada (B) y disminución de la expresión (C) con eliminación de IGF2BP3 utilizando la herramienta web de análisis de enriquecimiento de listas de genes ENRICHR. Las listas de términos utilizadas en este análisis fueron GO_Biological_Processes y KEGG para determinar procesos enriquecidos y vías de nuestra lista de validación cruzada de 269 genes sensibles y dirigidos a IGF2BP3. Las líneas de puntos verticales representan PAG valor de cortePAG & lt 0,05). KD, derribo.

Los ARNm de CDK6 y MYC son objetivos de IGF2BP3 in vitro e in vivo. Entre las muchas dianas de ARNm de IGF2BP3, CDK6 y MI C son muy importantes en la patogenia de la LLA-B translocada por MLL (6, 7). En nuestro conjunto de datos de pacientes, los casos de LLA-B translocados por MLL demostraron niveles altos de estos genes, en consonancia con su función propuesta como dianas unidas y reguladas por IGF2BP3 (Figura complementaria 1, A y B). Para probar la hipótesis de que IGF2BP3 regula postranscripcionalmente la expresión de CDK6 y MI C a través de sitios de unión en su 3'UTR, generamos una serie de vectores utilizando un sistema indicador de luciferasa dual que contiene los respectivos UTR (Figura 8A). los CDK6 Se clonó 3'UTR (10 kb) en 5 piezas separadas (CDK6-1 a CDK6-5). La cotransfección de los vectores de luciferasa con IGF2BP3 resultó en un aumento de la actividad de luciferasa en CDK6-3 a CDK6-5, así como la MI C Reporteros 3'UTR (Figura 8B). Esto, junto con los datos de iCLIP y RNA-Seq, confirma que la unión de IGF2BP3 a las 3'UTR de estos genes puede estabilizar el mRNA y / o potenciar la traducción. Mutación de uno de los sitios de unión dentro del MI C 3'UTR, designado MYC Δ3, resultó en una atenuación pequeña pero reproducible de la mejora dependiente de IGF2BP3 de la MI C Reportero 3'UTR (Figura 8C). Sin embargo, la mutación de los sitios de unión de IGF2BP3 individuales en el CDK6 Las 3'UTR, seguidas de la sobreexpresión de IGF2BP3 y un ensayo de luciferasa, no mostraron ninguna diferencia significativa (datos no mostrados). Estos hallazgos pueden resultar de una de las siguientes posibilidades: (i) la unión puede no ser suficiente para alteraciones de la expresión génica, o (ii) la unión cooperativa en múltiples sitios puede ser necesaria para un efecto sobre la expresión génica. De hecho, se han observado algunos paralelismos en el caso de los miR, donde se observa una mayor represión en objetivos con múltiples sitios de unión (28). No obstante, se podría predecir que la unión de IGF2BP3 conduciría a niveles aumentados de CDK6 y MYC en las células que sobreexpresan IGF2BP3 y a niveles reducidos en las células knockdown.

CDK6 y MYC son el objetivo de IGF2BP3. (A) Esquema del ensayo de luciferasa utilizado. (B) Ensayo de luciferasa que muestra el direccionamiento del CDK6 y MI C 3′UTR por IGF2BP3 (t prueba *PAG = 0.05 PAG = 0,0250 CDK6-4, PAG = 0,0475 CDK6-5, PAG = 0,0165 MYC). (C) Supresión del MI C Los sitios de unión de 3'UTR de IGF2BP3 condujeron a una actividad de luciferasa modesta pero significativamente disminuida (t prueba *PAG = 0.05 PAG = 0,0120 MYC, PAG = 0,0294 MYC Δ3). (D y mi) El análisis de CDK6 de los progenitores de BM muestra una cantidad significativamente mayor de proteína CDK6 en las células de BM GFP + (t prueba *PAG = 0.0213) (D) pero no en la GFP - (mi) células. (F y GRAMO) La tinción intracelular para MYC revela niveles significativamente aumentados en las células de BM GFP + después de la expresión forzada de IGF2BP3 (t prueba ****PAG & lt 0,0001) (F) pero no en la GFP - (GRAMO) células. norte = 8 para los 3 grupos. (H y I) Después Igf2bp3 derribo en 7OZ / 3 celdas (t probar IGF2BP3 si1 y si2, respectivamente ***PAG = 0.0007, ***PAG = 0,0005), hay una expresión reducida de la proteína CDK6 y MYC (H). En la línea celular RS411, Western blot confirmó la eliminación de la proteína IGF2BP3 y la expresión reducida de la proteína CDK6 (I). Los experimentos se realizaron 3 veces para su validación. Los datos representan la media ± DE. Véase también la figura complementaria 7. hI3, IGF2BP3 PE humano, ficoeritrina.

Para dilucidar si IGF2BP3 se dirige a CDK6 y MYC in vivo, realizamos tinción intracelular en células de BM de ratones con expresión de IGF2BP3 forzada y medimos la intensidad de fluorescencia media (MFI) mediante citometría de flujo. Las células BM GFP + derivadas de ratones que expresan IGF2BP3 humano tenían un aumento de MFI para CDK6 y MYC (Figura 8, D y F). Como control, las células GFP - de ambos grupos no mostraron ninguna diferencia (Figura 8, E y G). Para complementar estos datos in vivo, analizamos los niveles de proteína CDK6 y MYC en líneas celulares donde IGF2BP3 fue anulado usando ARNip previamente. Hubo una disminución sustancial en los niveles de proteína CDK6 en las células RS411 después de la caída de IGF2BP3 (Figura 8I). Similar, Igf2bp3 la caída en la línea celular murina pre-B 7OZ / 3 condujo a una reducción en la proteína CDK6 y MYC (Figura 8, H e I). Estos hallazgos están de acuerdo con los datos de RNA-Seq y demuestran una función conservada para IGF2BP3 (Figura 7A).

A nivel de ARNm, la sobreexpresión de IGF2BP3 condujo a un aumento leve pero significativo en Mi c niveles de ARNm, pero no en Cdk6, en BM a granel (Figura complementaria 7, A y B). Es posible que un aumento en Cdk6 Es posible que el ARNm no se detecte debido a la heterogeneidad de las células de la BM o porque los efectos sobre la estabilidad del ARNm por IGF2BP3 pueden ser específicos del ARNm. De manera similar, las células murinas 7OZ / 3 mostraron un modesto aumento en la Cdk6 Niveles de ARNm cuando se sobreexpresó IGF2BP3 murino (Figura complementaria 7, C-E). Estos hallazgos corroboran la unión de IGF2BP3 y el posterior aumento traduccional de estos genes diana. En general, estos experimentos demuestran el direccionamiento de CDK6 y MYC por IGF2BP3 en una variedad de sistemas, y eso puede ser la base de los efectos fenotípicos observados de la expresión forzada.

IGF2BP3 mutado no aumenta el número de progenitores hematopoyéticos in vivo. IGF2BP3 tiene 6 dominios de unión a ARN: 2 dominios de motivo de reconocimiento de ARN (RRM) y 4 dominios de dominio de homología K (KH) que se predice que median la función de unión de ARN de IGF2BP3. Creamos 2 mutantes de deleción: el mutante KH, que contiene solo los 4 dominios KH y desprovisto de ambos dominios RRM, y el mutante RRM, que contiene los 2 dominios RRM y carece de los 4 dominios KH (Figura 9, A y F). Se realizó un trasplante de BM murino con mutantes MIG, WT IGF2BP3, KH y RRM en receptores irradiados letalmente. A diferencia de la proteína WT, la expresión forzada de estas proteínas mutantes no provocó un aumento de la hematopoyesis o el sesgo hacia las células B y los linajes mieloides que observamos anteriormente. Los ratones receptores mutantes mostraron un injerto reducido (Figura 9, B y C). Los recuentos de células B y células mieloides en la periferia mostraron una tendencia hacia la normalización en ratones mutantes IGF2BP3 (Figura 9, D y E). Un ensayo de luciferasa utilizando el MI C 3'UTR y la comparación de WT e IGF2BP3 mutante demostraron una actividad luciferasa disminuida, lo que confirma la idea de que estos mutantes ya no se unen y / o estabilizan los ARNm diana (Figura 9G). Curiosamente, un estudio informó que el papel de los dominios KH no se comprende bien en IGF2BP3, entre los diversos miembros de la familia IGF2BP (29). Aunque no se conocen los determinantes precisos de la unión del ARN, nuestros hallazgos proporcionan un ímpetu para realizar análisis detallados de estructura-función para dilucidar dominios y residuos importantes para la función de IGF2BP3. Junto con nuestros datos de alto rendimiento, estos experimentos proporcionan algunos de los primeros estudios completos que vinculan la función de unión de ARN de esta proteína a fenotipos a nivel de organismo.

Expresión de mutantes del dominio de unión al ARN de IGF2BP3 in vivo e in vitro. (A) Esquema de IGF2BP3 con sus dominios de unión y los respectivos mutantes (KH y RRM). (B) Evolución temporal del injerto normalizado a MIG en PB entre 4 y 20 semanas después del trasplante. (C) FACS de PB realizado 4 semanas después del BMT, que muestra positividad para CD45.2 y GFP (ANOVA unidireccional seguido de la prueba de Bonferroni ***PAG & lt 0,001). (D) Células B en PB 16 semanas después del trasplante. (mi) Células mieloides en PB 12 semanas después del trasplante. norte = 8 para todos los grupos. El experimento de BMT mutante se completó dos veces para su validación. (F) Western blot confirmó la expresión de las proteínas IGF2BP3 (64 kDa), KH (47 kDa) y RRM (22 kDa) en 7OZ / 3 usando anticuerpos anti-T7 (panel superior) y anti-IGF2BP3 (inferior). Actina utilizada como control de carga. (GRAMO) El ensayo de luciferasa muestra un aumento de la actividad de luciferasa para el MI C 3′UTR cuando se cotransfecta con hI3 y disminución de la actividad luciferasa para el MI C 3′UTR cuando se cotransfecta con mutantes KH y RRM (t prueba hI3, K, H y RRM ***PAG & lt 0,001 ****PAG & lt 0,0001). El experimento se completó 3 veces. Los datos representan la media ± DE. hI3, IGF2BP3 PB humano, sangre periférica.

El mecanismo molecular de la leucemogénesis mediada por proteínas de fusión MLL no se comprende completamente, a pesar del conocimiento de la translocación y las proteínas de fusión resultantes durante 2 décadas. Cada vez más, se reconoce que los cambios secundarios no genéticos son necesarios para la elaboración de la leucemia. Por ejemplo, la desregulación de las marcas epigenéticas por DOT1L, que es reclutada por la proteína de fusión MLL-AF4, es un mecanismo oncogénico clave (30). En este estudio, encontramos que un RBP, IGF2BP3, está sobreexpresado en casos de B-ALL que llevan una translocación de la MLL gene. Proponemos que la desregulación de la expresión génica postranscripcional también puede desempeñar un papel importante en la leucemogénesis. Esto se ve confirmado por estudios previos de otra RBP, musashi-2, que demostraron que se expresaba altamente en la leucemia mieloide aguda y que su sobreexpresión podría colaborar con BCR-ABL para promover la leucemogénesis mieloide (31). Otro ejemplo reciente es la proteína HuR, que está regulada al alza en múltiples neoplasias epiteliales y se sabe que estabiliza sus objetivos al unirse a elementos ricos en AU dentro de la 3'UTR de los ARNm diana (32). Nuestros hallazgos aquí amplían el repertorio de expresión de RBP desregulada a B-ALL, proporcionando nuevos conocimientos sobre esta enfermedad.

El mecanismo de regulación positiva de IGF2BP3 en la leucemia que expresa MLL-AF4 es una cuestión importante. Nuestros estudios mostraron que un inhibidor del dominio BET podría regular a la baja IGF2BP3 en RS411, y se cree que esto se dirige específicamente a la transcripción mediada por MLL a dosis bajas (23). Los informes anteriores también han demostrado que IGF2BP3 se regula al alza después de la sobreexpresión de MLL-AF4 en células de BM murinas (4).Curiosamente, un ensayo indirecto de ChIP-Seq realizado en células SEM (que llevan la translocación MLL-AF4) mostró la unión de la proteína de fusión al locus genómico que contiene IGF2BP3 (33). Por tanto, es tentador especular que IGF2BP3 es un objetivo transcripcional directo de las proteínas de fusión MLL. Sin embargo, IGF2BP3 también se sobreexpresa en la mayoría de las líneas de células B-ALL probadas, varias neoplasias de células B maduras (34 - 37) y varias neoplasias malignas epiteliales. Además, se ha observado una regulación diferencial de esta proteína en B-ALL (38). Por tanto, el mecanismo de su regulación positiva puede incluir otras vías oncogénicas.

Anteriormente, se ha demostrado que la eliminación de IGF2BP3 en líneas de células epiteliales reduce la proliferación celular y causa apoptosis (18, 37, 39). Encontramos que la eliminación o eliminación de IGF2BP3 por ARNip o por el sistema CRISPR-Cas9 condujo a una proliferación celular reducida y a un aumento de la apoptosis en RS411, una línea celular que expresa MLL-AF4, y NALM6, otra línea celular B-ALL que muestra niveles altos de IGF2BP3. Estos hallazgos destacan el importante papel que puede desempeñar la regulación génica postranscripcional en el mantenimiento del comportamiento maligno de las células B-ALL. Será de gran interés estudiar si B-ALL con niveles bajos de expresión de IGF2BP3 demuestran un repertorio de unión de ARN alterado, con el objetivo de iluminar los ARNm clave que median los efectos posteriores de IGF2BP3.

Para estudiar la función patogénica de esta proteína, también creamos el primer modelo in vivo de expresión forzada de IGF2BP3 en el sistema hematopoyético murino. Encontramos que IGF2BP3 aumenta el número de HSC, LMPP y CLP en la BM con un aumento concomitante en la tasa de proliferación de HSC y LMPP. IGF2BP3 confería una ventaja de reconstitución competitiva y hematopoyesis de ratón sesgada hacia las células B y el linaje mieloide en la periferia, con leucocitosis en la sangre periférica, infiltración de células B atípicas en la médula tímica y aumento de células mieloides en el bazo. Aunque los ratones no desarrollaron leucemia manifiesta a los 6 meses después del trasplante, estas características de desarrollo anormales son similares a las que se observan al principio de la leucemogénesis impulsada por MLL, que incluyen la expansión de la célula B y el linaje mieloide. Dichos efectos impulsados ​​por IGF2BP3 sobre las células madre y progenitoras y los destinos de diferenciación pueden extenderse más allá del sistema hematopoyético. IGF2BP3 puede causar remodelación del páncreas exocrino cuando se sobreexpresa específicamente en ese tejido y se expresa altamente en células madre cancerosas / células iniciadoras de tumores en carcinoma hepatocelular (40, 41).

Se sabe que IGF2BP3 se dirige a los ARNm para IGF2, CD44y el factor de transcripción HMGA2 (16, 42). Otros informes sobre HMGA2 e IGF2BP han sugerido que pueden desempeñar un papel en el potencial de autorrenovación de las HSC fetales (43, 44). Se sabe que Let-7 miR inhibe la migración e invasión de células tumorales al dirigirse a IGF2BP3 (45). Por tanto, IGF2BP3 puede funcionar regulando los procesos oncogénicos y de desarrollo. Para examinar el mecanismo molecular detrás de las alteraciones observadas en la homeostasis celular y hematopoyética, realizamos análisis iCLIP-Seq. Sorprendentemente, identificamos numerosos objetivos de ARN de IGF2BP3 en líneas celulares B-ALL que eran objetivos conocidos de MLL, incluidos CDK6 y MI C. CDK6 se ha implicado recientemente como un objetivo muy importante en B-ALL, y la inhibición de CDK6 puede formar la base de una nueva intervención terapéutica en B-ALL (7). MYC es un oncogén por excelencia y su sobreexpresión juega un papel causal directo en muchas leucemias de células B y en linfomas. Los ensayos de reportero confirmaron que la interacción de IGF2BP3 con las 3'UTR de MI C y CDK6 son funcionalmente importantes. IGF2BP3 con deleciones de dominios de unión a ARN no logró unirse y estabilizarse MI C ARNm en el ensayo indicador de luciferasa. Sin embargo, cuando se eliminaron sitios de unión únicos de IGF2BP3 en el MI C y CDK6 3'UTR, la mayoría de estas deleciones no lograron revertir el fenotipo en el ensayo indicador. La complejidad de la selección de diana 3'UTR se ilustra por la variedad de RBP y ARN no codificantes que se ha informado que se unen al MI C y CDK6 3'UTR (46 - 49). Por lo tanto, la acción de la RBP sobre sus dianas afines es probable que dependa de la dosis y las RBP múltiples cooperativas deben unirse a la misma UTR 3 'en diferentes ubicaciones para ejercer un efecto. Se confirmó el direccionamiento in vivo e in vitro de la proteína CDK6 y MYC en las líneas celulares de leucemia y BM de ratón, tanto en la configuración de pérdida como de ganancia de función. Por lo tanto, hemos validado iCLIP como una técnica poderosa para descubrir objetivos relevantes para la enfermedad. Es importante señalar que es probable que existan ARNm distintos a MI C y CDK6 que interactúan con IGF2BP3, incluidos los que identificamos aquí, que juegan un papel importante en la proliferación y / o diferenciación celular. Esto se ilustra en nuestro intento de rescatar la muerte celular mediada por la caída de IGF2BP3 cotransduciendo células RS411 con MI C constructos que contienen o carecen de 3'UTR. MYC solo no fue suficiente para rescatar los cambios en el ciclo celular engendrados por la pérdida de función de IGF2BP3 (datos no mostrados).

Los análisis de iCLIP-Seq proporcionan una visión global del transcriptoma regulado por IGF2BP3. Estudios previos han demostrado objetivos únicos o pocos para esta proteína, pero nuestro trabajo aquí muestra varios cientos de ARNm unidos por esta proteína. Para refinar nuestra lista de posibles transcripciones, combinamos esta identificación de diana bioquímica con estudios de expresión génica en células con pérdida de función de IGF2BP3. Distintos conjuntos de genes que estaban unidos por IGF2BP3 mostraron regulación positiva o negativa, con genes regulados negativamente que demostraron enriquecimiento para las vías relacionadas con el ciclo celular y la leucemia. Estos hallazgos sugieren que la regulación positiva de IGF2BP3 en B-ALL sirve para estabilizar la expresión del gen leucemógeno. Al igual que otros modos de regulación de la expresión génica postranscripcional, las acciones de IGF2BP3 dependen del programa de transcripción celular. IGF2BP3 en sí mismo es inducido por MLL-AF4, y se une a varios ARNm y los regula al alza (p. Ej., CDK6 y MI C) que también son inducidos por MLL-AF4. De esta manera, IGF2BP3 puede reforzar ciertos aspectos del programa de expresión génica, manteniendo así la oncogénesis. Curiosamente, sin embargo, la expresión forzada de esta proteína sola también condujo a la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas, lo que sugiere que la especificidad de la estabilización del ARN y / o la mejora de la traducción puede dirigir el desarrollo e influir en la elección y la proliferación del linaje.

Dado que las mutaciones y translocaciones oncogénicas se están catalogando a través de varios enfoques de secuenciación de alto rendimiento, también se hace evidente que las anomalías genéticas únicas son insuficientes para causar oncogénesis. Trabajos anteriores han implicado mecanismos no genéticos, incluida la regulación epigenética, como factores clave en el camino hacia la oncogénesis en toda regla. Aquí, nuestros estudios han descubierto un mecanismo postranscripcional de estabilización de productos génicos oncogénicos como CDK6 y MYC. Este mecanismo requiere más estudio y aclaración y es probable que proporcione información importante sobre la naturaleza de la regulación de la expresión génica en la leucemogénesis. Con el surgimiento de terapias dirigidas contra CDK6 y MYC, será fundamental considerar el papel de los mecanismos postranscripcionales en la regulación de los programas de expresión génica mediados por oncogenes. Además, el estudio actual también sugiere vías terapéuticas, incluida la generación de ARN sumideros para bloquear la unión de IGF2BP3 a sus objetivos o inhibidores de moléculas pequeñas de esta proteína diseñada para bloquear su función de unión de ARN. Dada la expresión de IGF2BP3 en muchos tipos diferentes de cáncer, será de gran interés definir si el repertorio de ARNm unidos es similar en tumores de histogénesis distinta y si las vías oncogénicas conservadas pueden dirigirse en neoplasias malignas hematológicas y no hematológicas.

Muestras de pacientes, aislamiento de células CD19 + y análisis de datos de microarrays. Todos los procedimientos y protocolos relacionados con estos se han descrito previamente, y el conjunto de datos de microarrays se ha puesto a disposición del público (NCBI's Gene Expression Omnibus [GEO GSE65647]) (21).

Análisis de apoptosis, proliferación y ciclo celular. Para medir la proliferación celular, se cultivaron entre 2000 y 4000 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Los reactivos MTS se agregaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Promega CellTiter 96 AQueous Kit de ensayo de proliferación celular no radiactiva) y las células se incubaron a 37 ° C, 5% de CO2 durante 4 horas antes de medir la absorbancia a 490 nm. Para medir la apoptosis, las células se tiñeron con anexina V etiquetada con APC y se analizaron mediante citometría de flujo. Para el análisis del ciclo celular, las células se fijaron con etanol al 70% y se tiñeron con solución de yoduro de propidio 1x en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo.

qPCR. El ARN recogido de muestras humanas se transcribió de forma inversa utilizando reactivo iScript (Quanta BioSciences). El ARN de las líneas celulares se transcribió de forma inversa usando qScript (Quanta BioSciences). La qPCR se realizó con el sistema de PCR en tiempo real StepOne Plus (Applied Biosystems) utilizando el reactivo PerfeCTa SYBR Green FastMix (Quanta BioSciences). Las secuencias del cebador qPCR utilizadas se enumeran en la Tabla complementaria 5.

Western blot. Las células se lisaron en tampón RIPA (Boston BioProducts) suplementado con Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific). Se sometieron a electroforesis cantidades iguales de lisado de proteína (cuantificadas mediante el ensayo de proteína de ácido bicinconínico, BCA [Thermo Scientific]) en una SDS-PAGE al 5% -12% y se sometieron a electrotransferencia en una membrana de nitrocelulosa. Los anticuerpos utilizados fueron c-MYC conejo policlonal (catálogo 9402, Cell Signaling Technology), CDK6 conejo monoclonal (catálogo DCS83, Cell Signaling Technology), IGF2BP3 cabra policlonal (catálogo sc-47893, Santa Cruz Biotechnology Inc.), T7 conejo policlonal (catálogo AB3790, Millipore) y β-actina (catálogo AC15, Sigma-Aldrich) monoclonal de ratón. Se utilizaron anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc.) y el kit SuperSignal West Pico (Pierce Biotechnology) para una detección mejorada basada en quimioluminiscencia.

Cultivo celular, plásmidos e infección por espín. Se clonaron ARNip formateados con mmu-miR-155 o hsa-miR-21 entre los sitios NotI y BamHI de un vector lentiviral pHAGE6 (pHAGE6-CMV-siRNA-UBC-ZsGreen) o entre los sitios NotI y BamHI de un vector pHAGE6 modificado aguas abajo de GFP (CMV-GFP-ARNip-UBC-Puromicina). En líneas celulares de ratón, se clonaron ARNip e insertos que codifican proteínas en vectores MGP y MIG (50). El WT IGF2BP3 y los mutantes de deleción (KH y RRM) con una etiqueta de epítopo T7 se clonaron entre los sitios BglII y XhoI en un vector basado en MIG (MSCV-T7 tag-Mutant CDS-IRES-GFP Ver Tabla complementaria 5). Para la focalización mediada por CRISPR-Cas9, los ARN guía se diseñaron utilizando el sitio web del laboratorio de Zhang (http://crispr.mit.edu/) y se clonaron en el vector LentiCRISPR (24). Las células RS411 se infectaron por centrifugación a 30ºC durante 90 minutos en presencia de polibreno. Las células se seleccionaron con 5 µg / ml de puromicina durante 7 días y se utilizaron para ensayos de apoptosis y proliferación celular. Las líneas celulares de LLA-B humana RS411 (MLL-AF4 translocado ATCC CRL-1873), NALM6 (obsequio de K. Sakamoto, Universidad de Stanford, Stanford, California, EE. UU.), 697 (obsequio translocado E2A-PBX1 de K. Sakamoto) , Reh (ATCC CRL-8286 translocado en TEL-AML1), la línea celular leucémica pre-B murina 7OZ / 3 (ATCC TIB-158) y la línea celular HEK 293T (ATCC CRL-11268) se cultivaron en sus medios correspondientes a 37ºC. ° C en un 5% de CO2 incubadora. Los lentivirus y retrovirus se generaron como se describió previamente (50, 51).

Ensayo de trasplante de MO y repoblación competitiva. Se recogió BM y se infectó por rotación de ratones hembra C57BL / 6J donantes CD45.2 + de 8 semanas de edad como se describió previamente (50). También trasplantamos ratones donantes con IGF2BP3 etiquetado con epítopo T7 y construcciones mutantes, incluidos mutantes de deleción que carecen de dominios de unión a ARN. Se irradiaron letalmente ratones hembra B6.SJL-Ptprc-Pep3 / BoyJ receptores CD45.1 + de ocho semanas de edad y se inyectaron con BM del donante 6 horas después de la irradiación. Se utilizaron ocho ratones por grupo. En algunos experimentos, el injerto normalizado se calculó como el porcentaje de eficacia de injerto / transducción. Para experimentos de repoblación competitiva, se recolectaron ratones hembras CD45.1 + donantes B6.SJL-Ptprc-Pep3 / BoyJ de 8 semanas de edad y ratones hembras C57BL / 6J donantes CD45.2 + de 8 semanas de edad para la BM. CD45.2 + BM estaba infectado con virus que sobreexpresaban MIG, HOXA9 o IGF2BP3. Se mezclaron células de BM CD45.1 + y CD45.2 + en una proporción de 1: 1 y se inyectaron en ratones hembra C57BL / 6J receptores CD45.2 + de 8 semanas de edad irradiados letalmente. Un grupo de control negativo tenía 100% de células BM CD45.1 + inyectadas en ratones hembra C57BL / 6J receptoras CD45.2 + de 8 semanas de edad irradiados letalmente. Se extrajo sangre de los ratones a las 4, 8, 12, 16 y 20 semanas después de la inyección de BM para el análisis de la sangre periférica. Todos los ratones se compraron en el Laboratorio Jackson y se alojaron en condiciones libres de patógenos en UCLA.

Citometría de flujo. Se recogieron sangre, MO, timo y bazo de los ratones en condiciones estériles a las 27 semanas después del trasplante. Las suspensiones de células individuales se lisaron en tampón de lisis de glóbulos rojos. Se utilizaron anticuerpos conjugados con fluorocromo para la tinción. La lista de anticuerpos utilizados se proporciona en la Tabla complementaria 6. Para la tinción intracelular, después de la tinción inicial con anticuerpos marcadores de superficie y la fijación con paraformaldehído (PFA) al 1%, las células se incubaron con anticuerpos contra antígenos intracelulares (Ki67, Cdk6 y Myc) en Triton al 1% que contiene tampón MACS. Después de 30 minutos de tinción a 4ºC, las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron con PFA al 1%. La citometría de flujo se realizó en el UCLA JCCC y en el Broad Stem Cell Research Flow Core. El análisis se realizó utilizando el software FlowJo.

Histopatología. La fijación y el corte se describieron previamente (51). El análisis fue realizado por un hematopatólogo certificado por la junta (D.S. Rao).

iCLIP. El iCLIP se realizó como se describió anteriormente (52). Brevemente, se irradiaron células RS411 o REH con luz UV-C para formar proteínas de entrecruzamiento covalente irreversibles a ácidos nucleicos in vivo. Después de la lisis celular, el ARN se fragmentó parcialmente usando nucleasa microcócica y los complejos IGF2BP3-ARN se inmunopurificaron con anticuerpo anti-IGF2BP3 (MBL International Corporation) inmovilizado en perlas magnéticas recubiertas de proteína A (Invitrogen). Después de un lavado y desfosforilación rigurosos (FastAP, Fermentas), los ARN se ligaron en sus extremos 3 'a un adaptador de ARN preadenilado en 3', se marcaron radiactivamente, se corrieron usando electroforesis en gel de proteína basada en MOPS y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Los complejos proteína-ARN de 15 a 80 kDa por encima de la proteína libre se cortaron de la membrana y el ARN se recuperó mediante digestión con proteinasa K en condiciones de desnaturalización (urea 3,5 M). Los oligonucleótidos para la transcripción inversa contenían 2 regiones adaptadoras orientadas inversamente adaptadas del kit de preparación de bibliotecas de ARN pequeño Bioo NEXTflex (Bioo Scientific), separadas por un sitio de restricción BamHI y una región de código de barras en su extremo 5 'que contiene un código de barras específico del experimento de 4 nt. dentro de un código de barras aleatorio de 5 nt para marcar moléculas de ADNc individuales. Las moléculas de ADNc se purificaron por tamaño usando PAGE desnaturalizante, circularizado por CircLigase II (Epicenter, Illumina), hibridado con un oligonucleótido complementario al sitio de restricción y cortado usando BamHI (New England Biolabs Inc.). A continuación, se amplificaron por PCR los ADNc linealizados utilizando Immomix PCR Master Mix (Bioline) con cebadores (Bioo Scientific) complementarios a las regiones adaptadoras y se sometieron a secuenciación de alto rendimiento utilizando Illumina HiSeq. Se ha publicado una descripción más detallada del protocolo iCLIP (53). Los datos discutidos en esta publicación se han depositado en GEO de NCBI (54) (GSE76931).

Análisis de datos de iCLIP. Después de la alineación transcriptómica y genómica con "TopHat2" (55), las lecturas individuales se truncaron en sus extremos 5 'para representar el sitio de entrecruzamiento. Para denotar sitios específicos de interacción proteína-ARN, se determinaron regiones de enriquecimiento de 30 pb sobre el fondo utilizando "Piranha" (56) en modo binomial negativo truncado en cero con una covariable local personalizada. La covariable se calculó distribuyendo uniformemente el número de reticulación de cada contenedor de 30 pb en los 6 contenedores vecinos (3 en cada lado) para controlar las regiones de mayor profundidad general como una indicación de la interacción proteína-ARN. Contenedores adyacentes con significantes PAG los valores de Piranha (α & lt 0.05) se combinaron en regiones individuales. Solo las regiones de pico superpuestas que se encontraron estadísticamente significativas en las 3 réplicas se consideraron candidatas biológicamente reproducibles para análisis adicionales. Para derivar las distribuciones intragénicas de los sitios iCLIP-Seq, consultamos la base de datos UCSC Genome Browser MySQL para hg19 (57) y determinamos el gen superpuesto más cercano basado primero en las anotaciones del gen CCDS (58) para determinar el ORF canónico y segundo en Gencode V19 integral para otras funciones (59). Después de esto, se registró el ancla intragénica más cercana (sitio de inicio de la transcripción, codón de inicio, sitio de empalme 5 ', sitio de empalme 3', codón de terminación y sitio de poliadenilación) y se calculó la distancia de corte y empalme al límite de ORF más cercano. Como control de fondo, se simularon sitios de entrecruzamiento distribuidos uniformemente mediante intervalos pseudoaleatorios de hg19 utilizando “bedtools” (60). La distribución intragénica de estos sitios se determinó siguiendo la misma metodología que los sitios de enlace cruzado iCLIP.

Para determinar la especificidad de unión de IGF2BP3, se extrajo una ventana de 10 nt que rodea cada sitio de entrecruzamiento que ocurre dentro de un pico biológicamente reproducible y estadísticamente significativo de un último exón, y se calcularon los recuentos de cada n-mer (4 a 6) . Se incluyeron intervalos aleatorios de 20 pb de una ventana de 100 a 300 nucleótidos adyacentes a cada sitio de enlace cruzado como una frecuencia normalizada de n-meros para representar la probabilidad de fondo (p) de observar cada n-meros. Para cada tamaño de n-meros, la probabilidad de observar k ocurrencias de algunos n-meros de N observaciones totales se distribuye binomialmente (k

Bin [p, N]) y Poisson aproximados, dados valores suficientemente grandes para N (& gt1,000) y valores pequeños de PAG (& lt0.01). N-mers individuales con aproximación de Poisson PAG los valores significativos a una tasa de falso descubrimiento del 5% (61) se alinearon entre sí y se agruparon en motivos usando agrupación de k-medoides para valores óptimos de k (usando el ancho de silueta promedio). A continuación, se representó gráficamente la frecuencia de aparición de cada nucleótido de una manera específica de la posición para cada grupo de motivos.

Inmunoprecipitación de ARN. Se trataron Dynabeads de proteína A (Invitrogen) en tampón de fosfato de sodio 100 mM (pH 8,1) con anticuerpo de ratón IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.) o α-IGF2BP3 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) durante 1 hora a 4 ° C.A continuación, las perlas se lavaron 3 veces con tampón RSB-100 (Tris-Cl 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, MgCl 2,5 mM2, 0,5% NP-40). Se prepararon lisados ​​citoplásmicos a partir de células RS411 en suspensión en inhibidores de RNasa que contenían RSB-100. Los sobrenadantes de lisado se combinaron con la perla / anticuerpo, se rotaron a 4ºC durante la noche y se lavaron, y se extrajo una porción para análisis de transferencia Western. Las perlas sedimentadas se resuspendieron en tampón de proteinasa K (Tris-HCl 100 mM [pH 7,4], NaCl 50 mM, EDTA 10 mM [pH 8,0]). Las muestras se trataron con RQ DNasa I (Promega) y luego se trataron con Proteinasa K (Ambion), ambas se incubaron a 37 ° C. El ARN se extrajo con ácido fenol-cloroformo y se precipitó con acetato de sodio, etanol absoluto y coprecipitado GlycoBlue (Ambion). El ARN se recuperó por centrifugación, se lavó y se resuspendió en agua sin ARNasa. La cantidad y la calidad se comprobaron con el kit Nanodrop y Total RNA NanoBioanalyzer (Agilent Technologies). Las muestras de ARN (200 μg de cada muestra por triplicado de los controles de IgG y las inmunoprecipitaciones de α-IGF2BP3) se sometieron a transcripción inversa utilizando el kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Thermo Scientific) y posterior qPCR utilizando el Lightcycler 480 (Roche Diagnostics).

Experimentos de secuenciación de ARN. El ARN se purificó a partir de ambas fracciones citosólicas de células RS411 agotadas o de control con IGF2BP3 usando TRI-Reagent LS (Sigma-Aldrich), se convirtió en bibliotecas de doble hebra usando el NEXTflex Rapid Directional qRNA-Seq Library Prep Kit (Bioo Scientific) y se secuenció utilizando la plataforma Illumina HiSeq 2500. Los datos de secuenciación de ARN de alto rendimiento generados por Illumina HighSeq 2500 y correspondientes a aproximadamente 30 a 115 millones de lecturas por muestra (Tabla complementaria 4) se asignaron a la construcción de hg19 del genoma humano (febrero de 2009 GRCh37, NCBI Build 37.1) utilizando el software Bowtie y TopHat (62, 63). Toda la recopilación y análisis de datos se realizó con Perl y los análisis estadísticos con R, versión 2.14.1. Todos los paquetes de bibliotecas externas utilizados están disponibles en CPAN o CRAN. Los genes expresados ​​diferencialmente se identificaron usando DESeq. Los datos son accesibles a través de GEO de NCBI (GSE76931).

Ensayos de luciferasa. los CDK6 3'UTR tiene una longitud aproximada de 10 kb, mientras que MI C 3'UTR es aproximadamente 300 pb. MYC Δ3 y MYC Δ4 son mutantes MI C 3'UTR que carecen de sitios de unión de IGF2BP3 determinados a partir de datos de iCLIP. Se diseñaron cebadores para excluir estos sitios de unión, se completó la PCR de fusión y se clonaron MYC y MYC Δ 3'UTR aguas abajo de luciferasa de luciérnaga en el vector pmirGlo entre los sitios SacI y XhoI (64). los CDK6 3′UTR se dividió en 5 piezas (CDK6 1–5

2 kb cada uno) y clonados individualmente aguas abajo de la luciferasa de luciérnaga. Las células 293T se transfectaron con los vectores indicadores que contienen pmirGlo, 3'UTR o Δ 3'UTR junto con el vector vacío MIG, el vector de sobreexpresión MIG-hIGF2BP3, el vector de sobreexpresión MIG-T7-hIGF2BP3 o el mutante MIG-T7-KH / RRM vectores en una proporción de 1:10 (50: 500 ng). Las cotransfecciones se realizaron con Lipofectamine 2000 (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Las células se lisaron después de 24 horas, se añadió sustrato y se midió la luminiscencia en un GloMax-Multi Jr (Promega). Se calculó la relación de actividad luciferasa de luciérnaga a Renilla para todas las muestras. La luminiscencia de hIGF2BP3 / MIG o mutante / MIG para el vector vacío pmirGlo se utilizó como control de normalización.

Estadísticas. Los datos representan la media ± DE para datos numéricos continuos. ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Bonferroni o la prueba de Student de 2 colas t Las pruebas se realizaron utilizando el software GraphPad Prism y se aplicaron a cada experimento como se describe en las leyendas de las figuras. A PAG se consideró significativo un valor inferior a 0,05. *PAG & lt 0.05, **PAG & lt 0.01, ***PAG & lt 0,001 y ****PAG & lt 0,0001.

Aprobación del estudio. La Asociación Italiana de Hematología y Oncología Pediátrica (AIEOP) y el ensayo ALL-2000 de Berlín-Frankfurt-Muenster (BFM) obtuvieron el consentimiento informado por escrito de todos los padres de los pacientes. El IRB de la Universidad de Padova aprobó todos los procedimientos y el estudio se consideró exento de revisión en UCLA. Las células mononucleares de sangre periférica derivadas de donantes anonimizados se obtuvieron del Center for AIDS Research Virology Core Lab en UCLA o después del trabajo de diagnóstico del Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio de UCLA con consentimiento por escrito y aprobación del IRB. Todos los procedimientos experimentales con ratones se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Investigación Animal del Canciller de UCLA (ARC).

JKP diseñó el estudio, realizó los experimentos, analizó los datos y redactó el artículo. JRS y DSR diseñaron el estudio, analizaron los datos y redactaron el artículo. TMT y JMH realizaron los experimentos, analizaron los datos y redactaron el artículo. JRC y TRF realizaron los experimentos. TSW, SK, MT, WY, MP y GB analizaron los datos.

Agradecemos a los miembros del laboratorio Rao por sus útiles discusiones. Agradecemos a Parth Patel, May Paing, Norma Iris Rodriguez-Malave, Jennifer King, Jaspal Bassi, Kim Pioli, Nolan Ung y Jaime Anguiano por su apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por la subvención del NIH R01 CA166450, una subvención inicial de UCLA JCCC y un Premio al Desarrollo Profesional K08CA133521 (para D.S. Rao), así como por las subvenciones del NIH R01GM109146 y R21AG042003 (para J.R. Sanford). J.R. Contreras fue apoyado por la Beca de Capacitación en Inmunología de Tumores, NIH T32CA009120. T.R. Fernando recibió el apoyo de la Beca de capacitación en biología tumoral NIH T32CA009056. J.M. Howard fue apoyado por R41HG007336. La citometría de flujo se realizó en la instalación central de citometría de flujo UCLA JCCC / CFAR que cuenta con el respaldo de NIH AI-28697, P30CA016042, JCCC, UCLA AIDS Institute y David Geffen School of Medicine en UCLA.

La dirección actual de Jayanth Kumar Palanichamy es: Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciencias Médicas de la India, Nueva Delhi, India.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existe ningún conflicto de intereses.

Informacion de referencia: J Clin Invest. 2016126 (4): 1495–1511. doi: 10.1172 / JCI80046.


9.12C: Virus oncogénicos de ARN - Biología

Quizás ninguna enfermedad esté más fuertemente identificada con fines del siglo XX que el síndrome de inmunodeficiencia adquirida, comúnmente conocido como SIDA. Sin embargo, según un informe de las Naciones Unidas de 2004 sobre el estado de la epidemia mundial de SIDA, la enfermedad aún no ha comenzado a reducir su control sobre la población mundial a pesar del hecho de que el SIDA generalmente no recibe la misma atención pública que antes. hizo. Por el contrario, las infecciones están aumentando en muchos países, incluidas las naciones de altos ingresos como Estados Unidos. En 2003, casi cinco millones de personas contrajeron el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) que causa el SIDA, el mayor número de nuevas infecciones en un solo año desde que el SIDA se reconoció oficialmente como una enfermedad por primera vez en 1981.

El virus responsable del VIH fue aislado por primera vez en 1983 por Robert Gallo de los Estados Unidos y el científico francés Luc Montagnier. Desde entonces, se ha llevado a cabo una enorme cantidad de investigación centrada en el agente causante del SIDA y se ha aprendido mucho sobre la estructura del virus y su curso de acción típico. El VIH es uno de un grupo de virus atípicos llamados retrovirus que mantienen su información genética en forma de ácido ribonucleico (ARN). Mediante el uso de una enzima conocida como transcriptasa inversa, el VIH y otros retrovirus son capaces de producir ácido desoxirribonucleico (ADN) a partir del ARN, mientras que la mayoría de las células llevan a cabo el proceso opuesto, transcribiendo el material genético del ADN en ARN. La actividad de la enzima permite que la información genética del VIH se integre permanentemente en el genoma (cromosomas) de una célula huésped.

Los hospedadores primarios del VIH son los glóbulos blancos, denominados linfocitos T auxiliares, linfocitos T auxiliares o linfocitos T CD4 +. Estas células son componentes importantes del sistema inmunológico que normalmente son responsables de activar las respuestas de muchas otras células inmunitarias. Las células T auxiliares que se infectan con el VIH mueren rápidamente. Poco después de la infección primaria, el organismo suele compensar la pérdida de células T infectadas al producirlas en mayores cantidades, momento en el que las personas infectadas por el VIH son asintomáticas. Sin embargo, con el tiempo, el virus se vuelve cada vez más agudo y hay una disminución lenta de las células T colaboradoras. En consecuencia, el número de células T auxiliares en el cuerpo (denominado recuento de CD4) se utiliza generalmente para medir el avance del virus. Un recuento de CD4 de menos de aproximadamente 200 células por microlitro de sangre puede ir acompañado de una variedad de infecciones oportunistas y se considera la etapa final de la infección. El aluvión persistente de tales infecciones es lo que típicamente conduce a la muerte de los pacientes con SIDA.

El VIH es un virus relativamente complejo que puede infectar a las células T colaboradoras principalmente debido a una glicoproteína incrustada en su envoltura llamada gp120 (ver Figura 1) que se adhiere a CD4, una proteína que se encuentra en la superficie de las células T. También se cree que la entrada del VIH en una célula huésped implica un correceptor en la superficie celular, ya sea CCR5 o CXCR4, que normalmente funcionan como receptores de quimiocinas. La envoltura del virus del VIH es un derivado de la membrana plasmática de una célula huésped, obtenida por gemación. Cuando el VIH intenta entrar en una célula, las interacciones entre las moléculas de la superficie celular y las proteínas de la envoltura viral permiten que la envoltura se fusione con la membrana celular. Se sabe que la proteína de la envoltura llamada gp41 juega un papel importante en este proceso.

En una célula infectada, el VIH se somete a una transcripción inversa, produciendo ADN de doble hebra a partir de su ARN con la ayuda de la transcriptasa inversa, una enzima específica de virus especializada que transcribe el ADN de una plantilla de ARN. Una vez en forma de ADN, la información genética del VIH se incorpora como un provirus con el ADN de la célula huésped. El genoma provírico se puede transcribir posteriormente en ARN viral que funciona como ARNm para la traducción a proteínas del VIH y como genomas para la generación posterior del virus. Las cápsides se forman alrededor de los genomas y proteínas virales antes de que broten de la membrana celular, encapsulando aún más el material en envolturas.

El proceso de replicación del VIH está asociado con una tasa de mutación muy alta porque la transcripción inversa no permite la corrección de errores en la incorporación de nucleótidos. El VIH evoluciona a un ritmo un millón de veces más rápido que la evolución del genoma humano, lo que hace que sea extremadamente difícil para el sistema inmunológico reconocerlo y combatirlo de manera efectiva. Por razones similares, el desarrollo de medicamentos o vacunas para el VIH es una tarea complicada, el virus no solo varía mucho de un paciente a otro, sino que incluso presenta discrepancias genómicas significativas en los individuos. Una cura para el VIH sigue siendo difícil de alcanzar, pero los avances significativos han mejorado enormemente la calidad de la atención que los pacientes pueden recibir. La terapia antirretroviral altamente activa (HAART), que implica el uso de múltiples inhibidores de la proteasa y la transcriptasa inversa, ha demostrado ser una forma de tratamiento altamente beneficiosa para muchos pacientes, pero el costo de la terapia ha impedido su uso generalizado en muchas partes del mundo. afectados por el VIH y el SIDA.


9.12C: Virus oncogénicos de ARN - Biología

Los retrovirus comprenden una familia diversa de virus de ARN con envoltura, notable por su uso de la transcripción inversa del ARN viral en ADN lineal bicatenario durante la replicación y la posterior integración de este ADN en el genoma de la célula huésped. Los miembros de esta familia incluyen patógenos importantes como el VIH-1, la leucemia felina y varios virus que causan cáncer. Sin embargo, el interés en estos virus se extiende más allá de su capacidad de causar enfermedades. Por ejemplo, la investigación en esta área condujo al descubrimiento de oncogenes, un avance importante en el campo de la genética del cáncer. Los estudios de retrovirus han contribuido en gran medida a nuestra comprensión de los mecanismos que regulan la expresión de genes eucariotas. Además, los retrovirus están demostrando ser valiosas herramientas de investigación en biología molecular y se han utilizado con éxito en la terapia génica (por ejemplo, para tratar la inmunodeficiencia combinada grave ligada al cromosoma X).

Escrito por los mejores especialistas en retrovirus, este libro revisa la genómica, la biología molecular y la patogénesis de estos importantes virus, cubriendo de manera integral todos los avances recientes. Los temas incluyen: interacciones del huésped y retroelementos, retrovirus endógenos, proteínas y genomas retrovirales, entrada y desvanecimiento viral, transcripción e integración inversa, transcripción, empalme y transporte de ARN, patogénesis de infecciones oncovirales, patogénesis de infecciones por virus de inmunodeficiencia, factores de restricción retrovirales, vacunas moleculares y correlatos de protección, vectores gammaretrovirales y lentivirales, retrovirus de mamíferos y peces no primates, retrovirus exógenos de simios y HTLV y VIH. Lectura imprescindible para todo retrovirólogo y texto recomendado para todos los laboratorios de virología y biología molecular.

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"un resumen sucinto y de vanguardia de la biología no solo de los retrovirus sino también de otros retroelementos. Trabajo de referencia completo, conveniente y satisfactorio" de Microbiology Today (2010)

"Recomendable para investigadores de ciencias de la vida y todos los estudiantes de biología" de Arzneimittelforschung (2010) 60: 466-469

(EAN: 9781904455554 9781912530977 Temas: [virología] [microbiología] [microbiología médica] [microbiología molecular] [genómica])


Estar o no estar infectado: vehículos eléctricos en estrategias pro y antivirales

In vivo, los vehículos eléctricos pueden interactuar con los virus y entre sí, ya sea directamente o mediante la modulación de las respuestas del huésped, participando así en una “Guerra y Paz” entre virus y huésped (49, 50). Algunos virus inducen a las células infectadas a liberar EV modificados que facilitan la infección aumentando el grupo de células diana susceptibles (p. Ej., Aumentando el número de células activadas) o su susceptibilidad a la infección viral o sirviendo como señuelos que absorben anticuerpos antivirales, comprometiendo así inmunidad antiviral. Por el contrario, los VE que llevan proteínas virales también pueden ser beneficiosos para el huésped, por ejemplo, proporcionando a las células dendríticas antígenos virales para facilitar el inicio de respuestas inmunes adaptativas. Hipotéticamente, la capacidad de los vehículos eléctricos para regular la vida útil de las células permisivas y modificar las respuestas inmunitarias antivirales puede brindar una flexibilidad adicional al huésped para responder a la infección viral. Por lo tanto, los EV formados durante la infección viral pueden desempeñar funciones pro o contravirales (Fig. 3). Actualmente se desconoce si las diversas funciones atribuidas a los EV inducidos por virus pueden explicarse en parte por las diferencias en la pureza de las poblaciones de EV utilizadas en varios estudios. Por lo tanto, todavía falta una comprensión general de los parámetros que determinan el efecto neto de los vehículos eléctricos en las infecciones virales.

Efectos provisionales y antivirales de los vehículos eléctricos liberados por células infectadas con retrovirus. La infección por retrovirus puede conducir a la liberación de EV modificados que facilitan o suprimen la infección. Los posibles efectos antivirales incluyen (A) Entrega mediada por EV de componentes antivirales, como APOBEC3G, para aumentar la resistencia a las infecciones (B) propagación de ligandos de TLR, como el ARN viral, a través de VE para advertir a las células vecinas no susceptibles de la presencia de una infección viral y (C) suministro de células presentadoras de antígeno con antígeno viral para facilitar el inicio de respuestas inmunes adaptativas. Los efectos provirales potenciales incluyen (D) inhibición del efecto neutralizante del EV, que conduce a una disminución de la unión del EV a los viriones y a un aumento del número de viriones que pueden infectar otras células (mi) Entrega mediada por EV de componentes virales (p. Ej., Nef) que inducen la senescencia celular o la muerte de células inmunes antivirales (F) Entrega mediada por EV de componentes virales que inhiben la función de las células inmunitarias (p. Ej., Regulación a la baja de la producción de anticuerpos inducida por Nef por las células B) y (GRAMO) aumento del conjunto de células susceptibles a virus, por ejemplo, mediante transferencia de correceptores para la unión del virus a otras células.

Los vehículos eléctricos facilitan la infección viral.

Se han detectado varias proteínas y ARN del VIH en los vehículos eléctricos liberados por las células infectadas por el VIH. Uno de los componentes virales liberados a través de los EV es el ARN del elemento de respuesta a la transactivación del VIH (TAR) (51). La TAR es una estructura de bucle de ARN ubicada en los extremos 5 'de las transcripciones del VIH-1, que en las células infectadas pueden unirse a Tat, lo que facilita el reclutamiento de factores de elongación y el aumento de la producción de ARN viral (52). Cuando se transfiere a través de vehículos eléctricos, el ARN TAR puede aumentar la población de células diana susceptibles. Dentro de las células dirigidas a EV, el ARN TAR de longitud completa se procesa en miARN, que silencian el ARNm que codifica la proteína interactiva Bcl-2. El consiguiente aumento de la resistencia a la apoptosis permite que la célula produzca virus durante un período más prolongado, lo que facilita la infección por VIH (51).

Además, los EV liberados por las células infectadas por el VIH incorporan selectivamente el factor de virulencia del VIH Nef mediante la interacción de la región de modificación de la secreción de Nef con la mortalina, un miembro de la familia de chaperonas Hsp70 implicadas en el tráfico de proteínas celulares (53). El suministro de Nef asociado a EV a las células T afecta a estas células de varias formas. Primero, el Nef transferido puede activar las células T, haciéndolas más susceptibles a la infección por VIH (54). En segundo lugar, los vehículos eléctricos pueden administrar Nef a algunas de las células T CD4 + transeúntes e inducir la senescencia celular o la muerte (55). Este mecanismo puede contribuir al alto nivel de muerte de células T durante las primeras etapas de la infección por VIH, cuando la carga viral aún es baja (55). Finalmente, la transferencia intercelular de Nef por los EV puede facilitar la evasión de la respuesta inmune humoral al suprimir la producción de IgG2 e IgA en las células B, como también se ha demostrado para la transferencia de Nef por los macrófagos infectados por el VIH a las células B a través de conductos intercelulares (56).En sistemas in vitro, se ha demostrado que los VE pueden transferir los correceptores CCR5 y CXCR4 del VIH a otras células, lo que las hace propensas a la infección por el VIH (57, 58). Este proceso mediado por EV puede expandir el espectro de las células infectadas por el VIH, pero aún se desconoce si tal fenómeno juega un papel importante in vivo.

Los vehículos eléctricos suprimen la infección viral.

En experimentos in vitro, se ha demostrado que las células T pueden producir EV que contienen el receptor CD4 del VIH. Estos EV pueden adherirse a partículas virales, lo que reduce el número de viriones que, de otro modo, infectarían las células T CD4 + (59). Sin embargo, el VIH puede contrarrestar esto estimulando la incorporación de VIH-Nef en estos vehículos eléctricos, lo que conduce a la inhibición de la incorporación de CD4 en los vehículos eléctricos y a una disminución de la eficacia de la respuesta antiviral del huésped descrita anteriormente (59).

Otro mecanismo de protección de la célula huésped mediado por EV contra el VIH implica el transporte mediado por EV de la proteína antiviral del huésped APOBEC3G. Esta citidina desaminasa generalmente se incorpora en viriones junto con ARN retroviral e inhibe la replicación viral creando mutaciones G-a-A en el ADN viral transcrito (60). La acción antiviral de APOBEC3G es contrarrestada por la proteína Vif codificada por el VIH, que interfiere con la incorporación de APOBEG3G en los viriones. La administración de APOBEC3G sin Vif a través de EV puede contrarrestar el efecto de Vif y, por lo tanto, aumentar la resistencia de las células dirigidas a EV a la infección por VIH (34). De manera similar, datos recientes indican que el segundo mensajero cíclico guanosina monofosfato-adenosina monofosfato (cGAMP) (inducido por cGAMP sintasa) está encerrado tanto en las partículas del VIH como en los vehículos eléctricos que se liberan de las células infectadas. La transferencia intercelular de cGAMP, aunque lograda de manera más eficiente por virus que por EV, desencadena respuestas antivirales de IFN en células recién infectadas de una manera dependiente de un estimulador de genes de interferón (STING) (35, 36).

Los EV de células infectadas por virus no solo contienen (mi) ARN endógenos, sino que también se ha demostrado que se enriquecen selectivamente en ARN virales (p. Ej., En el caso de los EV inducidos por el VHC) (38). Los PRR en células dirigidas a EV pueden reconocer tales ARN como patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP) y responder desencadenando la respuesta antiviral innata (38, 61). Los macrófagos infectados por el VIH también liberan EV que contienen ARN virales (miARN virales vmiR88 y -99) que desencadenan la señalización endosomal TLR8 y NF-κB en macrófagos transeúntes dirigidos a EV (61). La posterior producción de citocinas proinflamatorias (p. Ej., TNFα) contribuye al inicio de la respuesta inmunitaria contra el VIH. La diseminación de ARN viral a través de VE proporciona una estrategia para advertir a las células vecinas no susceptibles de la presencia de una infección viral. Durante la infección por VHC, por ejemplo, las DC plasmocitoides son el objetivo de los EV que contienen ARN viral y, como resultado, inician una respuesta inflamatoria (38). Además, los VE que contienen miARN del huésped producido por células resistentes a virus pueden conferir resistencia a otras células. Esto se ha demostrado para los trofoblastos, que son en gran medida resistentes a la infección por varios virus, incluido el VIH, lo que probablemente contribuye a la protección del feto in vivo. Los vehículos eléctricos producidos por estas células in vitro transportan miARN del huésped y los entregan a las células susceptibles a virus, lo que las hace resistentes a la infección por virus (62).


John Joseph Karijolich, Ph.D.

La asociación entre la infección por virus y la neoplasia está bien establecida para una variedad de cánceres. De hecho, aproximadamente el 12% de los cánceres humanos en todo el mundo son causados ​​por infecciones virales oncogénicas, y más del 80% de los casos ocurren en el mundo en desarrollo. A pesar de su prevalencia e importancia para la salud pública, nuestra comprensión y capacidad para manejar los cánceres inducidos por virus aún es limitada. Esto se debe en parte a la complejidad de las interacciones huésped-virus que conducen a la transformación celular.

La investigación en nuestro laboratorio se centra en definir la interacción huésped-virus en el contexto de la infección por gammaherpesvirus. & # 191-herpesvirus, que incluyen los virus oncogénicos humanos del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) y el virus de Epstein Barr (EBV), son una familia de grandes virus linfotróficos de ADN bicatenario que son los agentes causantes de una variedad de trastornos, incluyendo enfermedades linfoproliferativas, linfomas, así como otros cánceres no linfoides en mamíferos. Los estudios de la respuesta del huésped a la infección viral se han centrado históricamente en genes que codifican proteínas, por lo que nuestra comprensión de cómo el transcriptoma no codificante de proteínas, incluidos los ARN no codificantes tanto virales como derivados del huésped, impacta en las interacciones huésped-virus es limitada. En esta línea, nuestros principales objetivos de investigación se dirigen a comprender cómo los ARN no codificantes y sus proteínas de unión a ARN se integran en la regulación de la expresión génica y la modulación de la respuesta inmune del huésped durante la infección por herpesvirus. Para lograr esto, emprendemos un enfoque multidisciplinario que combina virología, inmunología, bioquímica del ARN, proteómica y genómica / transcriptómica. Las principales preguntas temáticas del laboratorio incluyen:

1) ¿Cuáles son las especies de ARN no codificantes endógenas y exógenas que contribuyen a la modulación inmune innata y cómo están mediadas estas funciones?

2) ¿Cómo da forma el sistema inmune innato intrínseco de la célula al ciclo de vida del herpesvirus y cuáles son las entidades huésped y viral en juego?

3) ¿Cuál es la contribución de los retrovirus y transposones endógenos a la interacción huésped-virus?

Ye X, Zhao Y, Karijolich J. El panorama del inicio de la transcripción a través de genomas de KSHV latentes y líticos. PLoS Pathog. 15 de junio de 2019 (6): e1007852. PMID: 31188901, PMCID: PMC6590836, PII: PPATHOGENS-D-19-00162, DOI: 10.1371 / journal.ppat.1007852, ISSN: 1553-7374.

Heinrich MJ, Purcell CA, Pruijssers AJ, Zhao Y, Spurlock CF, Sriram S, Ogden KM, Dermody TS, Scholz MB, Crooke PS, Karijolich J, Aune TM. Los elementos endógenos de ARN de Alu bicatenario estimulan las respuestas de IFN en la esclerosis múltiple remitente recidivante. J. Autoimmun [impreso-electrónico]. 100 de junio de 2019: 40-51. PMID: 30826177, PMCID: PMC6513682, PII: S0896-8411 (18) 30699-1, DOI: 10.1016 / j.jaut.2019.02.003, ISSN: 1095-9157.

Zhao Y, Ye X, Dunker W, Song Y, Karijolich J. La detección del receptor tipo RIG-I de los ARN del huésped facilita la respuesta inmune intrínseca de la célula a la infección por KSHV. Nat Commun. 2018 19/11/2018 9 (1): 4841. PMID: 30451863, PMCID: PMC6242832, PII: 10.1038 / s41467-018-07314-7, DOI: 10.1038 / s41467-018-07314-7, ISSN: 2041- 1723.

Dunker W, Song Y, Zhao Y, Karijolich J. FUS regula negativamente la expresión del gen del herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi. Virus. 2018 7/6/2018 10 (7): PMID: 29986386, PMCID: PMC6070805, PII: v10070359, DOI: 10.3390 / v10070359, ISSN: 1999-4915.

Hesser CR, Karijolich J, Dominissini D, He C, Glaunsinger BA. La modificación de N6-metiladenosina y la proteína lectora YTHDF2 desempeñan funciones específicas de tipo celular en la expresión génica viral lítica durante la infección por herpesvirus asociada al sarcoma de Kaposi. PLoS Pathog. 14 de abril de 2018 (4): e1006995. PMID: 29659627, PMCID: PMC5919695, PII: PPATHOGENS-D-17-02239, DOI: 10.1371 / journal.ppat.1006995, ISSN: 1553-7374.

Zhao Y, Dunker W, Yu YT, Karijolich J. El papel de la pseudouridilación de ARN no codificante en los eventos de expresión de genes nucleares. Frente Bioeng Biotechnol. 2018 6: 8. PMID: 29473035, PMCID: PMC5809436, DOI: 10.3389 / fbioe.2018.00008, ISSN: 2296-4185.

Dunker W, Zhao Y, Song Y, Karijolich J. Reconocimiento de los SINE de la infección: regulación de la expresión de retrotransposón y modulación de los procesos de la célula huésped. Virus. 2017 18/12/2017 9 (12): PMID: 29258254, PMCID: PMC5744160, PII: v9120386, DOI: 10.3390 / v9120386, ISSN: 1999-4915.

Ge J, Karijolich J, Zhai Y, Zheng J, Yu YT. El tratamiento con 5-fluorouracilo altera la eficacia de la recodificación traslacional. Genes (Basilea). 2017 31/10/2017 8 (11): PMID: 29088058, PMCID: PMC5704208, PII: genes8110295, DOI: 10.3390 / genes8110295, ISSN: 2073-4425.

Karijolich J, Zhao Y, Alla R, Glaunsinger B. El mapeo de todo el genoma de ARN SINE inducidos por infección revela un papel en la exportación selectiva de ARNm. Res de ácidos nucleicos [impreso-electrónico]. 2017 15 de marzo de 2017 PMID: 28334904, PII: 3071714, DOI: 10.1093 / nar / gkx180, ISSN: 1362-4962.

Zhao Y, Karijolich J, Glaunsinger B, Zhou Q. La pseudouridilación de 7SK snRNA promueve la formación de 7SK snRNP para suprimir la transcripción del VIH-1 y escapar de la latencia. Representante de EMBO [impreso-electrónico]. 2016 Agosto 24/16/2016 PMID: 27558685, PII: embr.201642682, DOI: 10.15252 / embr.201642682, ISSN: 1469-3178.

Huang C, Karijolich J, Yu YT. Detección y cuantificación de 2'-O-metilación y pseudouridilación de ARN. Métodos [impresos-electrónicos]. 2016 1 de julio de 2016 103: 68-76. PMID: 26853326, PMCID: PMC4921259, PII: S1046-2023 (16) 30021-4, DOI: 10.1016 / j.ymeth.2016.02.003, ISSN: 1095-9130.

Karijolich J, Yi C, Yu YT. Dinámica de la pseudouridilación del ARN en todo el transcriptoma. Nat. Rev. Mol. Cell Biol [impreso-electrónico]. 16 de octubre de 2015 (10): 581-5. PMID: 26285676, PII: nrm4040, DOI: 10.1038 / nrm4040, ISSN: 1471-0080.

Karijolich J, Yu YT. La nueva era de la modificación del ARN. ARN. 21 de abril de 2015 (4): 659-60. PMID: 25780180, PMCID: PMC4371322, PII: 21/4/659, DOI: 10.1261 / rna.049650.115, ISSN: 1469-9001.

Karijolich J, Abernathy E, Glaunsinger BA. Los ARN no codificantes derivados de retrotransposones inducidos por infección mejoran la expresión del gen del herpesvirus a través de la vía NF-¿B. PLoS Pathog. 2015 11 (11): e1005260. PMID: 26584434, PMCID: PMC4652899, PII: PPATHOGENS-D-15-02010, DOI: 10.1371 / journal.ppat.1005260, ISSN: 1553-7374.

Karijolich J, Yu YT. Supresión terapéutica de codones de terminación prematura: mecanismos y consideraciones clínicas (revisión). En t. J. Mol. Med [impreso-electrónico]. 2014 agosto 34 (2): 355-62. PMID: 24939317, PMCID: PMC4094583, DOI: 10.3892 / ijmm.2014.1809, ISSN: 1791-244X.

Karijolich J, Zhao Y, Peterson B, Zhou Q, Glaunsinger B. El herpesvirus asociado al sarcoma de Kaposi ORF45 media la activación transcripcional de la repetición terminal larga del VIH-1 a través de RSK2. J. Virol [impreso-electrónico]. 2014 junio 88 (12): 7024-35. PMID: 24719417, PMCID: PMC4054375, PII: JVI.00931-14, DOI: 10.1128 / JVI.00931-14, ISSN: 1098-5514.

Lim SJ, Scott A, Xiong XP, Vahidpour S, Karijolich J, Guo D, Pei S, Yu YT, Zhou R, Li WX. Requisito de CRIF1 en interferencia de ARN y estabilidad de Dicer-2. ARN Biol. 2014 11 (9): 1171-9. PMID: 25483042, PMCID: PMC4615304, DOI: 10.4161 / rna.34381, ISSN: 1555-8584.

Karijolich JJ, Hampsey M. El complejo Mediator. Curr. Biol. 2012 18/12/2012 22 (24): R1030-1. PMID: 23257183, PII: S0960-9822 (12) 01320-6, DOI: 10.1016 / j.cub.2012.11.011, ISSN: 1879-0445.

Karijolich J, Yu YT. Conversión de codones sin sentido en codones con sentido mediante pseudouridilación dirigida. Naturaleza. 2011 16/6/2011 474 (7351): 395-8. PMID: 21677757, PMCID: PMC3381908, PII: nature10165, DOI: 10.1038 / nature10165, ISSN: 1476-4687.

Huang C, Karijolich J, Yu YT. Modificación postranscripcional de ARN mediante RNP de Box H / ACA y Box C / D artificiales. Methods Mol. Biol. 2011 718: 227-44. PMID: 21370052, PMCID: PMC4161979, DOI: 10.1007 / 978-1-61779-018-8_14, ISSN: 1940-6029.

Karijolich J, Yu YT. Modificaciones del ARNsn splicosomal y su función. RNA Biol [impreso-electrónico]. 7 de marzo de 2010 (2): 192-204. PMID: 20215871, PMCID: PMC4154345, PII: 11207, ISSN: 1555-8584.

Karijolich J, Kantartzis A, Yu YT. Análisis cuantitativo de modificaciones de ARN. Methods Mol. Biol. 2010 629: 21-32. PMID: 20387140, PMCID: PMC4154561, DOI: 10.1007 / 978-1-60761-657-3_2, ISSN: 1940-6029.

Karijolich J, Kantartzis A, Yu YT. Modificaciones del ARN: mecanismo que modula la expresión génica. Methods Mol. Biol. 2010 629: 1-19. PMID: 20387139, PMCID: PMC4154353, DOI: 10.1007 / 978-1-60761-657-3_1, ISSN: 1940-6029.

Karijolich J, Yu YT. Información sobre los componentes proteicos de Box H / ACA RNP. Proteómica Curr. 2008 1 de julio de 2008 5 (2): 129-37. PMID: 19829749, PMCID: PMC2760984, DOI: 10.2174 / 157016408784911936, ISSN: 1570-1646.

Moelling C, Oberschlacke R, Ward P, Karijolich J, Borisova K, Bjelos N, Bergeron L. Represión dependiente de metales de la formación de sideróforos y biopelículas en Actinomyces naeslundii. FEMS Microbiol. Lett [impreso-electrónico]. 275 de octubre de 2007 (2): 214-20. PMID: 17825071, PII: FML888, DOI: 10.1111 / j.1574-6968.2007.00888.x, ISSN: 0378-1097.

Karijolich J, Stephenson D, Yu YT. Purificación bioquímica de RNP box H / ACA implicados en la pseudouridilación. Metanfetamina Enzimol. 2007 425: 241-62. PMID: 17673087, PII: S0076-6879 (07) 25011-6, DOI: 10.1016 / S0076-6879 (07) 25011-6, ISSN: 0076-6879.

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Shou-Jiang (SJ) Gao, Ph.D.

El área de investigación principal en el laboratorio del Dr. Gao ha sido la oncogénesis viral, y actualmente se centra en el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi (KSHV) y las neoplasias malignas relacionadas con el SIDA. El laboratorio ha estado participando en un esfuerzo multidisciplinario y expandiendo el programa de investigación en terapias traslacionales y contra el cáncer, metabolismo del cáncer, microbiota, inflamación, angiogénesis, inmunidad innata y microARN. El laboratorio ha aplicado enfoques y tecnologías de vanguardia en genómica, epigenética, epigenética de ARN, metabolómica, detección genómica de alto rendimiento, detección de drogas de alto rendimiento y biología de sistemas para abordar estos problemas biomédicos de vanguardia. En particular, el laboratorio ha invertido recientemente en la detección y el descubrimiento de fármacos como resultado de la identificación de nuevos objetivos terapéuticos y el desarrollo de nuevos sistemas modelo para infecciones y cánceres. El laboratorio del Dr. Gao está bien respaldado por fondos externos. Actualmente hay 6 R01 activos y 1 subproyecto de un PPG activo. Estas son algunas de las direcciones y proyectos de investigación en curso:

1. Detección y descubrimiento de fármacos: el laboratorio ha desarrollado varios modelos de cáncer e infección, y los ha utilizado en la detección y detección de fármacos en todo el genoma mediada por Crispr-Cas9. El laboratorio ya ha identificado numerosos objetivos y agentes nuevos, que han demostrado ser eficaces tanto en modelos in vitro como in vivo.

2. Biología de sistemas: el laboratorio ha estado realizando trabajos en epigenética, epigenética de ARN y metabolómica en cáncer e infecciones.

3. Infecciones, inflamación e inmunidad innata: el laboratorio continúa estudiando microARN, inflamación, angiogénesis, inmunidad innata e infecciones.

Publicaciones representativas

Graffaz M, Zhou SH, Vasan K, Rushing T, Michael QL, Lu C, Jung JU, Gao S-J. Reutilización de citarabina para el tratamiento del linfoma de derrame primario dirigiéndose a las replicaciones líticas y latentes del KSHV. mBio, 2018, 9: e00756-18.

Tan B, Liu H, da Silva SR, Yuan HF, Sorel O, Zhang L, Meng J, Huang YF, Gao SJ. Epitranscriptomas de N6-metiladenosina y N6,2'-O-dimetiladenosina virales y celulares en el ciclo de vida del KSHV. Nature Microbiology, 2018, 3: 108-120

Graffaz M, Vasan K, Tan B, da Silva SR, Gao SJ. La inflamación mediada por TLR4 promueve la transformación celular inducida por KSHV y la tumorigénesis mediante la activación de la vía STAT3. Investigación sobre el cáncer, 2017, 77: 7094-7108.

Zhu Y, Li TT, da Silva SR, Jae-Jin Lee, Lu C, Hyungjin Eoh, Jung JU, Gao SJ. Un papel fundamental de la glutamina y el nitrógeno γ de la asparagina para la biosíntesis de nucleótidos en las células cancerosas secuestradas por un virus oncogénico. mBio, 2017, 8. pii: e01179-17. doi: 10.1128 / mBio.01179-17.

Zhu Y, da Silva SR, Liang QM, Lu C, Feng PH, Jung JU, Gao SJ. La supresión de la glucólisis por KSHV promueve la supervivencia celular y la transformación oncogénica. PLoS Pathogens, 2016, 12: e1005648.

Lee MS, Jones T, Song DY, Jang JH, Jung JU, Gao S-J. Explotación del sistema del complemento por el virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi oncogénico para la supervivencia celular y la infección persistente. PLoS Pathogens, 2014, 10: e1004412.

Moody R, Zhu Y, Huang YF, Cui XD, Jones T, Bedolla R, Lei XF, Bai ZQ, Gao S-J. Los microARN de KSHV median la transformación celular y la tumorigénesis al dirigirse de forma redundante a las vías de crecimiento y supervivencia celular. PLoS Pathogens, 2013, 9: e1003857.

Greene W, Zhang W, He ML, Witt C, Ye FC y Gao S-J. El sistema de ubiquitina / proteasoma regula la entrada del virus del herpes asociado al sarcoma de Kaposi en las células endoteliales. PLoS Pathogens, 2012, 8: e1002703.

Jones T, Ye FC, Bedolla RG, Huang YF, Meng J, Qian LW, Pan HY, Zhou FC, Moody R, Wagner, B, Arar M y Gao S-J. Transformación celular eficaz directa de células mesenquimales metanéfricas primarias de rata por KSHV. Revista de investigación clínica, 2012, 122, 1076-1081.

Lei XF, Bai ZQ, Ye FC, Xie JP, Kim CG, Huang YF y Gao S-J. Regulación del inhibidor de NF-kB IkBa y replicación viral por un microARN de KSHV. Nature Cell Biology, 2010, 12, 193-199.